1 A High Sensitivity UPLC/MS/MS Method for the Analysis of Clopidogrel and Clopidogrel Carboxylic Acid Metabolite in Human K2EDTA Plasma

Význam tématu

V klinické farmakokinetice je přesná a citlivá detekce klopidogrelu a jeho karboxylové kyseliny klíčová pro hodnocení biologické dostupnosti a optimalizaci dávkování u pacientů s rizikem aterotrombotických událostí. Nízké hladiny nezměněného prodrugu a vysoce reaktivního thiolového metabolitu vyžadují metody s vynikající selektivitou a citlivostí.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vytvořit robustní UPLC/MS/MS postup kombinovaný se solid-phase μElution extrakcí, který dosáhne dolní hranice stanovení 1 pg/mL v lidské plazmě K2 EDTA. Metoda má sloužit ke kvantitativnímu sledování nezměněného prodrugu i inaktivního karboxylového metabolitu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci analyzovaných látek byla použita chromatografie UPLC ACQUITY s kolonnou BEH C18 (1,7 μm, 1,0 × 50 mm) při 45 °C a průtoku 140 μL/min. Mobilní fáze A obsahovala 0,1 % kyseliny mravenčí, fáze B acetonitril, gradient od 10 do 90 % B během 3 minut.
Pro extrakci vzorků byla aplikována Oasis HLB μElution deska (pre-kondice methanol 200 μL, voda 200 μL), vzorek plazmy (350 μL) s interním standardem d4-klopidogrel (250 pg/mL) se naředil vodnou formi kyselinou a protáhl pod vacuum. Následovalo promytí formi kyselinou a směsí methanol/voda a eluční krok methanolem (2×25 μL), který se naředil vodou před injekcí.
Detekce probíhala na spektrometru Waters Xevo TQ-S v režimu pozitivní ESI s přechody 322.1 > 212.0 (klopidogrel), 308.1 > 198.1 (metabolit) a odpovídajícími deuterovanými interními standardy. Datová integrace a kvantifikace se prováděly v systému UNIFI.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární kalibraci v rozsahu 1–500 pg/mL bez pozorovatelného carry-over. Retenční časy metabolitu i prodrugu byly 1,7 a 2,8 min. Dolní hranice kvantifikace (LLOQ) 1 pg/mL poskytla poměr signál/šum 7:1 pro klopidogrel a 5:1 pro karboxylát. QC vzorky ve čtyřech úrovních splnily kritéria ±20 % pro LLOQ a ±15 % pro ostatní úrovně. Oddělení od fosfolipidových interferencí bylo potvrzeno pomocí přechodu 184 > 184.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost umožňuje sledování nízkých koncentrací prodrugu a metabolitu.
• Solid-phase μElution výrazně snižuje spotřebu organických rozpouštědel (<0,5 mL/ vzorek).
• Zkrácení doby analytického cyklu a zvýšení průchodnosti laboratoře.
• Robustní separace od matrice i fosfolipidových interferencí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace extrakčních a chromatografických systémů pro hromadnou analýzu.
• Multiplexní sledování metabolitů a kliničtější biomarkerů v jednom běhu.
• Automatizace preparativních kroků a integrace s on-line SPE.
• Personalizovaná farmakoterapie na základě individuální farmakokinetiky.

Závěr

Vyvinutá metoda UPLC/MS/MS ve spojení s μElution SPE dosáhla vysoké citlivosti (LLOQ 1 pg/mL), vynikající přesnosti, linearity i selektivity. Splňuje požadavky regulačních orgánů a nabízí praktické výhody pro bioanalytická laboratoře.

Reference

• J-M. Pereillo et al., Drug Metabolism and Disposition 30 (2002) 1288–1295.
• A. Robinson et al., Journal of Chromatography B 848 (2007) 344–354.
• J-J. Zou et al., Chromatographia 70 (2009) 1581–1586.
• M. El Sadek et al., American Journal of Analytical Chemistry 2 (2011) 447–455.