High Throughput Native MS With Robust Ion Source Operation For The Analysis Of Proteins And Protein Complexes

Význam tématu

Analýza proteinů a jejich komplexů v nativním režimu pomocí hmotnostní spektrometrie (MS) je klíčová pro pochopení struktury, funkce a interakcí biologických makromolekul. Vysokoprůchodová (high throughput) nativní MS s robustním provozem zdroje iontů umožňuje rutinní, rychlé a reprodukovatelné měření, které je důležité pro farmaceutický výzkum, kvalitativní i kvantitativní kontrolu (QA/QC) a charakterizaci bioterapeutik.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo ověřit proveditelnost použití vyšších průtokových rychlostí v kapilární LC/MS pro nativní analýzu proteinů a proteinových komplexů. Autoři testovali stabilitu a citlivost měření při zachování nativní konformace na příkladech alkoholdehydrogenázového tetrameru (ADH), β-galaktosidázového tetrameru a monoklonálního protilátkového standardu (NIST mAb). Studie zkoumala také vliv parametrů ionizačního zdroje na kvalitu spekter.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda byla založena na isokratické kapalinové chromatografii s přepínáním toku do odpadu po eluci proteinu, aby se omezilo znečištění zdroje iontů. Analytické podmínky:

• LC přístroj: Agilent 1260 Infinity II BioInert LC nebo 1290 Infinity II UHPLC
• Kolona: AdvanceBio SEC guard, 4.6×30 mm, 1.9 μm, 200 Å
• Mobilní fáze: 200 mM amonný acetát, 0.1 mL/min
• Přepínání toku do odpadu: první 3,8 min po eluci

Iontový zdroj a MS:

• Ionizační zdroj: Agilent Jet Stream s objemovou injekcí 1 μL
• Nebulizační tlak: 60 psig
• Teploty plynu: sheath 400 °C, drying 350 °C
• Kapilární napětí: 5 500 V, tryska 2 000 V
• Hmotnostní analyzátory: 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF a 6560 IM-QTOF
• Rozsah m/z: 90–10 000 nebo 790–14 100
• Rychlost akvizice: 0,5 spektra/s

Software pro akvizici a zpracování: Agilent MassHunter (v.9.1 a 10), BioConfirm, UniDec dekonvoluční software.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizací parametrů iontového zdroje bylo zjištěno, že vyšší teploty a průtoky plynu vedou k nejvyšší intenzitě signálu pro ADH tetramer. Zesílení signálu bylo závislé i na zvýšení nebulizačního tlaku. U všech sledovaných komplexů se podařilo zachovat nativní konformace s minimální denaturací. ADH tetramer vykázal rozšířený obal nábojových stavů (26+ až 14+), β-galaktosidázový tetramer a NIST mAb potvrdily vysokou citlivost a reprodukovatelnost měření. Použití iontové mobility dále rozlišilo konforméry u ADH tetrameru.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Rychlé (6 minut na vzorek), automatizované analýzy proteinů a komplexů v nativním stavu
• Minimální údržbu zdroje iontů díky odvodu solí a nízkomolekulárních látek do odpadu
• Vysokou reprodukovatelnost a robustnost provozu i při vyšších průtocích
• Detekci a charakterizaci posttranslačních modifikací a konformačních rozdílů

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zlepšení citlivosti a rozlišení pomocí optimalizace zdrojových parametrů a rozšířením iontové mobility. Rozvoj softwarových nástrojů pro automatizovanou dekonvoluci a interpretaci komplexních spekter podpoří širší nasazení v proteomice, vývoji bioterapeutik a výzkumu strukturálních biologií.

Závěr

Předložená studie prokázala, že high throughput nativní LC/MS s robustním iontovým zdrojem nabízí efektivní a spolehlivou platformu pro rutinní analýzu proteinů a jejich komplexů. Jeden univerzální režim zdroje iontů zajistil stabilní citlivost napříč různými biomolekulami s minimální nutností úprav.

Reference

1. VanAernum Z. et al.: Rapid Online Buffer Exchange for Native Mass Spectrometry. ChemRxiv (2019)
2. Marty M.T. et al.: Bayesian Deconvolution of Mass and Ion Mobility Spectra. Anal. Chem. 87 (2015)
3. Marty M.T.: Eliminating Artifacts in Electrospray Deconvolution. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 30 (2019)
4. Schachner L.F. et al.: Standard Proteoforms for Native Mass Spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 30 (2019)
5. Raj S.B. et al.: Yeast Alcohol Dehydrogenase Structure and Catalysis. Biochemistry 53 (2014)