Characterize Fab and Fc Fragments by Cation-Exchange Chromatography

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují klíčovou skupinu terapeutik pro léčbu nádorových a autoimunitních onemocnění. Cation-exchange chromatografie umožňuje odlišit nábojové varianty a posttranslační modifikace mAb, což je zásadní pro zajištění kvality a účinnosti biologických léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo otestovat schopnost kolony Agilent Bio MAb WCX účinně oddělit Fab a Fc fragmenty papainem štěpeného trastuzumabu a následně charakterizovat získané varianty pomocí hmotnostní spektrometrie po online desaltingu.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: štěpení trastuzumabu papainem, pH stres (1 M tris pH 9,0, 37 °C), případná redukce TCEP.
• Cation-exchange chromatografie: Agilent Bio MAb NP5 (2,1 × 250 mm, 5 μm), mobilní fáze A (20 mM MES pH 5,6) a B (20 mM MES pH 5,6 + 300 mM NaCl), gradient a detekce UV 214 nm.
• Online desalt a LC/MS: Agilent 1290 Infinity s Q-TOF 6540 UHD, Agilent Jet Stream, gradient formiátové kyseliny ve vodě/acetonitrilu.

Instrumentace

• Agilent 1290 Infinity LC System (Binary pump, Autosampler, termostat, kompartiment sloupce, DAD, frakční kolektor).
• Agilent 1100 Series (Degasser, Binary Pump, Autosampler, kompartiment, DAD).
• Agilent 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF s Jet Stream.

Hlavní výsledky a diskuse

• U nestresovaného vzorku CEX chromatogram ukázal čtyři hlavní peaky odpovídající fragmentům Fab a Fc a jejich modifikacím.
• MS dekonvoluce odhalila u Fab: varianta bez tripeptidu KTH, varianta s deamidací lehkého řetězce, a varianta s deamidací lehkého i těžkého řetězce; u Fc byly detekovány glykany G0F, G1F a G2F.
• U pH-stresovaného vzorku převládala deamidovaná varianta Fab a TCEP redukce potvrdila lokalizaci modifikací na LC i HC.

Přínosy a praktické využití metody

Popisovaný workflow kombinuje WCX chromatografii s vysokorozlišující MS a umožňuje detailní profilování nábojových variant mAb fragmentů, což podporuje kontrolu kvality v produkci biologik a vývoj biosimilars.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se očekává ve směru automatizace separačních a MS technik, zrychlení analýz posttranslačních modifikací, implementace umělé inteligence pro zpracování dat a rozšíření aplikace na další třídy biologik.

Závěr

Agilent Bio MAb WCX kolona prokázala efektivní oddělení nábojových variant papainových fragmentů trastuzumabu a kombinace s Q-TOF MS poskytla podrobnou charakterizaci posttranslačních modifikací.

Reference

1. I. Vandenheede, E. Dumont, P. Sandra, K. Sandra, M. Joseph. Characterize mAb Charge Variants by Cation-Exchange Chromatography. Agilent Technologies, Inc. Application Note 5991-5273EN, 2014.