Efficient Monoclonal Antibody and Antibody Drug Conjugate Desalting Prior to Mass Spectrometry Using AdvanceBio Desalting-RP Cartridges

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) a konjugáty protilátka–lék (ADC) představují klíčové bioterapeutické molekuly vyžadující přesnou hmotnostní a strukturální charakterizaci. Přítomnost nevolatilních solí a pomocných látek naformulovaných vzorků omezuje přímé měření elektrosprchovou ionizací (ESI). Online reverzně-fázová (RP) desaltingová technologie výrazně zrychluje přípravu vzorků a minimalizuje ztráty cenného materiálu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo demonstrovat použití AdvanceBio Desalting-RP kazety firmy Agilent pro online odstranění solí z mAb (trastuzumab) a ADC (ado-trastuzumab emtansine) před analýzou vysokorozlišovacím TOF-MS. Studie zahrnovala analýzu redukovaného a fragmentovaného Herceptinu (DTT, papain, IdeZ) a intactní ADC pro stanovení glykozylace, účinnosti desaltingu a výpočtu poměru DAR.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity LC: binární pumpa, autosampler, termostat
• AdvanceBio Desalting-RP kazeta (2,1 × 12,5 mm, 10 µm, 1 000 Å)
• Agilent Q-TOF MS: 6540, 6550 iFunnel a 6560 ion mobility, Jet Stream ESI
• Software: MassHunter Acquisition, Qualitative Analysis, BioConfirm, DAR Calculator

Použitá metodika

Vzorky byly připraveny třemi způsoby:

• DTT redukce mAb v Tris-HCl (10 mM DTT, 0,21 mg/mL, 60 °C, 1 h)
• Papainová digest: Herceptin 2 mg/mL, poměr enzym:protein 1:60, 37 °C, 2 h
• IdeZ digest: Herceptin 0,5 mg/mL v Na₂HPO₄/NaCl pH 6,6, poměr 1 U/µg, 37 °C, 1 h
• Intaktní vzorky v Tris pH 7,5, 2 mg/mL

Online RP desalting probíhal při 5 % acetonitrilu, s odváděním solí do odpadu, následným elucí gradientem do 80 % B a přepnutím diverteru do MS.

Hlavní výsledky a diskuse

• Efektivní desalting a částečná frakcionace fragmentů Lc/Hc, Fab/Fc a F(ab')₂/Fc/₂
• Vysoká reprodukovatelnost: RSD ploch špiček 0,5–5,7 % (pět replikací)
• Spolehlivé zjištění glykoformního profilu s RSD glykoform 0,7–8,4 %
• Intaktni analýza mAb i při až 300 mM NaCl, detekce intactní hmotnosti i při 50 ng náloži
• Stanovení DAR pro ADC Kadcyla s hodnotou 3,6, v souladu s literaturou
• Propojení ion mobility Q-TOF umožňuje rychlé rozlišení konformačních stavů

Přínosy a praktické využití metody

Online AdvanceBio Desalting-RP postup zkracuje čas přípravy, snižuje manuální manipulaci a zajišťuje vysokou kvalitu spekter přímo z formulovaných vzorků. Umožňuje rychlé potvrdění integrity, modifikací a glykoformního obsahu mAb a ADC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace modulárních desaltingových kazet do plně automatizovaných LC-MS workflow
• Rozšíření na jiné biologika (syntetické peptidy, proteiny, vícerozměrné fragmenty)
• Využití jemného řízení gradientu a imobilitní separace pro hlubší charakterizaci konformací
• Kombinace s novými iterativními algoritmy pro rychlejší dekonvoluci a kvantifikaci mutací či PTM

Závěr

AdvanceBio Desalting-RP cartridge představuje univerzální a spolehlivou metodu online desaltingu pro charakterizaci mAb a ADC. Zajišťuje vysokou přesnost, reprodukovatelnost i při malých náloží a odstraňuje nutnost předchozí offline desolvatace.

Reference

• Fenn J.B. a kol. Science 1989, 246, 64–71
• Kim M.T. a kol. Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1223–1232