Characterize mAb Charge Variants by Cation-Exchange Chromatography

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují klíčovou skupinu bioterapeutik, u nichž mohou během výroby a skladování vznikat drobné chemické modifikace vedoucí k heterogenitě nábojových variant. Přesná analýza těchto variant je nezbytná pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti léčivého přípravku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat schopnost kolony Agilent Bio MAb weak cation-exchange (WCX) účinně separovat nábojové varianty protilátky trastuzumab (Herceptin) a následně charakterizovat tyto frakce pomocí reverzní fáze LC a hmotové spektrometrie.

Použitá metodika

• Separace nábojových variant pomocí WCX chromatografie s pufry na bázi fosfátů při pH 7,65 a gradientu chloridu sodného.
• Sběr jednotlivých frakcí pH-stresovaného a nestresovaného materiálu.
• Redukce disulfidických vazeb DTT a následná analýza na C8 RP kolóně.
• Detekce UV při 214 nm a přesná hmotnostní analýza na Q-TOF MS.

Použitá instrumentace

• Agilent Bio MAb NP5 2,1×250 mm, 5 μm (WCX kolona)
• Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8 2,1×100 mm, 1,8 μm
• Agilent 1100/1200/1290 LC systémy (degasser, pumpy, autosamplery, kolónové termostaty, DAD detektory)
• Agilent 6540 UHD Q-TOF MS s JetStream
• Softwary: OpenLAB CDS ChemStation, MassHunter, BioConfirm

Hlavní výsledky a diskuse

• Opakovatelnost analýzy na WCX kolóně vykázala vysokou přesnost chromatogramů pěti replikát (RSD nízké hodnoty).
• Batch-to-batch konzistence tří výrobních šarží Herceptinu potvrdila obdobné procentuální zastoupení pre-, hlavního a post-peaku.
• pH-stresování (37 °C, pH 9,0) vyvolalo nárůst kyselých variant, identifikovaných jako deamidace Asn → Asp.
• Rozdělení frakcí následnou RP-LC umožnilo separovat varianty těžkého a lehkého řetězce a detekovat rozdíl 1 Da v dekonvoluovaných MS spektrách mezi ne/deamido formami.
• Podle intenzit špiček A a B bylo možné stanovit poměr jednonásobně a dvounásobně deamidovaných lehkých řetězců v jednotlivých CEX frakcích.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda umožňuje detailní profilování nábojové heterogenity mAb přímo na intact proteinu.
• Kombinace WCX, RP-LC a MS poskytuje podrobnou charakterizaci PTM a podporuje kontrolu jakosti a stability bioléků.
• Přesné určení deamidací napomáhá v optimalizaci výrobních a stabilitních procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření analýzy na další třídy PTM a glykosylace mAb.
• Automatizace frakčního odběru a integrace do vysokopropustného LC-MS workflow.
• Vývoj nových stacionárních fází pro rychlejší a citlivější separaci mAb variant.
• Pokročilé datové analýzy a strojové učení pro predikci stability bioterapeutik.

Závěr

Kombinace Agilent Bio MAb WCX chromatografie a následné RP-LC-MS analýzy efektivně separuje a charakterizuje nábojové varianty trastuzumabu. Tento přístup přináší robustní nástroj pro vývoj a kontrolu kvality monoklonálních protilátek.