Characterization of Monoclonal Antibodies Using Capillary Electrophoresis-Electrospray Ionization-Mass Spectrometry (CE-ESI-MS)

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAbs) se staly vůdčím léčivým nástrojem v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu díky své vysoké specificitě a terapeutické účinnosti. Jejich přesná charakterizace, včetně detekce heterogenity a posttranslačních modifikací, je nezbytná pro zajištění kvality, stability a bezpečnosti finálního produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Tento Application Note demonstruje využití kapilární elektroforézy spojené s hmotnostní spektrometrií (CE-ESI-MS) pro analýzu jak celých, tak redukovaných forem monoklonálních protilátek. Studie porovnává výsledky s tradiční LC/MS metodou a ukazuje, že CE/MS poskytuje srovnatelné i komplementární informace o hmotnostních modifikacích.

Použitá metodika

Analýza probíhala ve dvou krocích:

• Intaktní protilátky byly separovány CE na PVA kapiláře (70 cm, 50 μm ID) při pH 2,6 v 50 mM octanové kyselině a napětí 30 kV.
• Redukované vzorky po DTT úpravě umožnily izolaci lehkého a těžkého řetězce pro detekci glykozylačních variant.

Použitá instrumentace

• Kapilární elektroforéza: Agilent 7100 CE System s CE/MS kazetou (G1603A).
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS s ortogonálním trubicovým ESI rozhraním (G1607B).
• Sheath liquid: 0,5 % kyselina octová v 50 % methanolu (5 μL/min) dodávaná isokratickým pumpou Agilent 1200.
• Software: MassHunter Acquisition (B.06) a BioConfirm pro dekonvoluci a analýzu pMod algoritmem.

Hlavní výsledky a diskuse

CE-ESI-MS umožnila:

• Detekci intaktních IgG1 a IgG2 mezi 12–18 min s hmotnostmi v rozsahu 144 000–146 000 Da, přičemž byly identifikovány hlavní glykoformy (G0F/G1F, G1F/G1F, G2F/G1F, G0F/G0F).
• Při analýze redukovaných vzorků byly odděleny lehké řetězce (~22 930 Da) a těžké řetězce (~49 500 Da) s identifikací stejných glykoform a navíc detekcí modifikace N-acetylglukosaminu ve spektru CE/MS, která byla v LC/MS opomenuta.

Přínosy a praktické využití metody

CE-ESI-MS nabízí nízkou spotřebu vzorku (1–20 nL), vysoké rozlišení nabitých stavů a schopnost detekce drobných posttranslačních modificací. Metoda může sloužit jako doplněk k LC/MS v QA/QC laboratořích a výzkumu pro rychlou primární charakterizaci mAbs.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj CE/MS v oblasti:

• Automatizace workflow a integrace s datovými knihovnami pro rychlou identifikaci variant.
• Rozšíření na více typů proteinů a komplexních bioterapeutik.
• Kombinaci s vysoce výkonnou separací (mikročipy) pro zlepšení citlivosti a průchodnosti analýzy.

Závěr

Studie potvrdila, že kapilární elektroforéza spojená s ESI-MS je efektivní a citlivá technika pro charakterizaci intaktních i redukovaných monoklonálních protilátek. Doporučuje se jako hodnotný doplněk k běžnému LC/MS přístupu pro zajištění úplného obrazu heterogenity a modifikací mAbs.

Reference

1. Heemskerk, J. et al. Optimization and validation of a quantitative capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate method for quality control and stability monitoring of monoclonal antibodies. Anal. Chem. 2006, 78(18), 6583–6594.
2. Li, J. et al. Characterization of Therapeutic Antibodies and Related Products. Anal. Chem. 2012, 85(2), 715–736.
3. Zhou, Z. et al. Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics. Electrophoresis 2014, 35(1), 96–108.
4. Agilent Technologies. CE/MS and LC/MS Synergy, Complementary Solutions for Peptide Mapping, publ. 5991-2583EN.
5. Agilent Technologies. Analysis of Monoclonal Antibody (mAb) Using Agilent 1290 Infinity LC System Coupled to Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF, publ. 5991-4266EN.
6. Agilent Technologies. Primary Characterization of a Monoclonal Antibody Using Agilent HPLC-Chip Accurate-Mass LC/MS Technology, publ. 5990-3445EN.