LC/MS of Intact Therapeutic Monoclonal Antibodies Using Agilent AdvanceBio RP-mAb

Význam tématu

Analýza intaktních terapeutických monoklonálních protilátek (mAbs) je klíčová pro zajištění konzistence, účinnosti a bezpečnosti biologických léčiv. Post-translační modifikace, zejména glykozylace a konjugace léčivých sloučenin, vedou k mikroheterogenitě doprovázející výrobní procesy, které je nutné rychle a přesně charakterizovat.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na ověření schopností sloupců Agilent AdvanceBio RP-mAb (C4, SB-C8 a Diphenyl) pro rychlou a vysoce rozlišovací separaci intaktních mAb i konjugátů (ADC) v LC/MS metodě. Cílem bylo demonstrovat krátké analýzní časy, reprodukovatelnost a přesné určení molekulové hmotnosti mAb.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Příprava vzorků: mAb1, mAb2 a lys-konjugovaný ADC (mAb3) na koncentraci 1 µg/µl v roztoku 0,1 % kyseliny mravenčí v 3 % acetonitrilu, injekce 1 µl.
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity LC, sloupce AdvanceBio RP-mAb C4 (2,1 × 50 mm, 3,5 µm) a Diphenyl (2,1 × 75 mm, 3,5 µm), teplota 80 °C, průtok 0,6 ml/min, gradient od 20 % do 90 % mobilní fáze B za 11,1 min.
• Mobilní fáze: A: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě; B: 80 % isopropanol, 10 % acetonitril, 9,9 % voda, 0,1 % kyselina mravenčí.
• MS detekce: Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF s AJS ESI, pozitivní iontový režim, rozsah 2 000–6 000 m/z, dekonvoluce pomocí MaxEnt a pMod algoritmů v MassHunter BioConfirm.

Hlavní výsledky a diskuse

Oba testované sloupce poskytly ostré a úzké chromatografické píky (šířka základny ~0,5 min). Celkový iontový chromatogram a m/z spektra pro mAb1 a mAb2 ukazují úzký Gaussianův rozptyl nabitých stavů mezi 2 000–4 000 m/z. Dekonvoluce odhalila u mAb1 pět hlavních glykoform a u mAb2 čtyři. U ADC mAb3 se objevily rozštěpené píky odpovídající populacím s 0–8 molekulami navázaného terče, zachycující heterogenitu nákladu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza intaktních mAb a jejich konjugátů v řádu desítek minut.
• Vysoké rozlišení a reprodukovatelnost i při vysokých průtocích díky superficially porous částicím.
• Přesné určení molekulové hmotnosti a glykoformálního profilu vhodné pro QC a procesní kontrolu ve výrobě biologik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj bude směřovat k automatizaci vysokoprůtokových platform pro screening mAb, integraci pokročilých dekonvolučních algoritmů a rozšíření chemie stacionárních fází pro selektivnější separaci atypických modifikací. Využití ultrarychlých sloupců s širší škálou modifikací povrchu umožní detailnější charakterizaci nových molekulárně cílených terapií.

Závěr

Agilent AdvanceBio RP-mAb sloupce v kombinaci s Accurate-Mass Q-TOF LC/MS nabízejí spolehlivou, rychlou a vysoce rozlišovací platformu pro analýzu intaktních mAb a ADC, což usnadňuje kontrolu kvality a vývoj biologických léčiv.

Reference

1. Gritti, F. Chromatogr. Today June 2012, 4–11.
2. Gudihal, R.; Suresh Babu C. V.; Tang, N. Analysis of Monoclonal Antibody Using Agilent 1290 Infinity LC System Coupled to Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF; Application note, Agilent Technologies, Inc. Pub. 5991-4266EN, 2014.