Analysis of Monoclonal Antibody (mAb) Using Agilent 1290 Infinity LC System Coupled to Agilent 6530 Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF)

Význam tématu

Analýza monoklonálních protilátek (mAb) je klíčová pro biopharmaceutický průmysl, zejména v oblasti kvality (QC), impuritní kontroly a porovnávacích studií biosimilars. Vysokorozlišovací chromatografie a přesná hmotnostní spektrometrie umožňují detailní charakterizaci intactních protilátek i jejich redukovaných fragmentů, což přispívá k rychlejší detekci rozdílů v glykoformách a řetězcích protilátek.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat výkonnost Agilent 1290 Infinity LC systému spojeného s Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF pro:

• Analýzu intactních a redukovaných mAb (IgG1 vs IgG2)
• Vysokorozlišovací chromatografii s úzkými píky
• Deconvoluci a porovnání hmotnostních spekter pomocí software MassHunter BioConfirm

Použitá instrumentace

• LC systém: Agilent 1290 Infinity LC System
• Kolona: Agilent Poroshell 300SB-C8, 2.1 × 75 mm, 5 µm
• MS systém: Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF s Agilent JetStream ion source
• Software: Agilent MassHunter Qualitative Analysis a BioConfirm s pMod dekonvolučním algoritmem

Použitá metodika

Vzorky IgG1 a IgG2 byly připraveny v 0,1 % kyselině mravenčí (100 µg/ml) a injekcí 1 µl na LC. Pro redukci byly disulfidy štěpeny DTT při 60 °C po dobu 1 h. Chromatografické gradienty kombinovaly vodu s 0,1 % formiátovým pufrem (fáze A) a směs IPA/ACN/voda s 0,1 % formiátovým pufrem (fáze B). Celkové časy běhu intact metody dosahovaly 10,1 min, pro redukované vzorky 10 min. MS parametry zahrnovaly pozitivní režim ESI, rozsahy m/z 2 000–5 000 (intact) a 300–3 200 (redukce), akvizice 1–2 GHz.

Hlavní výsledky a diskuse

Intactní chromatogramy vykázaly úzké píky (base width ~0,5 min) a separaci dvou protilátek. pMod dekonvoluce odhalila 5 hlavních glykoform pro IgG1 (144 944 Da) a 4 pro IgG2 (144 498 Da). Po redukci byly lehké řetězce shodné (~22 929 Da), těžké řetězce se lišily (IgG1 49 475–49 799 Da vs IgG2 49 255–49 581 Da). Mirror ploty umožnily přímé vizuální srovnání a ukázaly, že rozdíly intactních protilátek vyplývají z odlišných těžkých řetězců, zatímco lehké řetězce jsou identické.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a vysoce rozlišovací QC analýza intactních a fragmentovaných mAb
• Detekce a kvantifikace glykoform a aduktů
• Podpora srovnávacích studií a biosimilars comparability
• Automatizovaná dekonvoluce a vizualizace rozdílů díky pMod algoritmu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj dekonvolučních algoritmů, integrace strojového učení pro predikci glykozylace, nasazení ultrarychlých nano-LC systémů a zvyšování rozlišení hmotnostních spektrometrů. Také se předpokládá větší automatizace workflow a robustní validace metodiky pro klinické a regulační aplikace.

Závěr

Popisovaná metoda kombinuje Agilent 1290 Infinity LC a 6530 Q-TOF s výkonným softwarem BioConfirm a pMod dekonvolucí, což umožňuje spolehlivou, rychlou a vysoce rozlišovací analýzu intactních a redukovaných monoklonálních protilátek. Tato platforma je vhodná pro QC, impuritní analýzy, porovnávací studie a vývoj biosimilars.

Reference

1. EvaluatePharma World Preview 2013, Outlook to 2018, EvaluateGroup, 2013.
2. Agilent Technologies, pMod – An Advanced Protein Deconvolution Algorithm with Automated Peak Modeling for Charge Deconvolution of Mass Spectrometry Data, 5991-2225EN.