Analysis of Monoclonal Antibody Digests with the Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution Part 2: HILIC × RPLC-MS

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek je klíčové pro detailní charakterizaci struktury, identifikaci modifikací a kontrolu kvality v biotechnologii. Vzhledem ke komplexitě tryptických digestů mAbs, které obsahují desítky až stovky peptidů s širokou škálou fyzikálně-chemických vlastností a koncentrací, je nezbytné využít separační techniky s vynikající kapacitou a ortogonalitou.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikované studie bylo demonstrovat použití systému Agilent 1290 Infinity 2D-LC v konfiguraci HILIC×RPLC on-line napojené na Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS pro rozšířené peptidové mapování tryptického digestu trastuzumabu. Studie popisuje optimalizaci separačního protokolu, modulaci mezi dimenzemi a aplikaci na stresované i nestresované vzorky.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byly na 100 µg trastuzumabu aplikovány standardní proteomické kroky: redukce DTT, alkylace IAA a tryptická digesce (1:25, 16 h při 37 °C), s čištěním nafázi s TFA a koncentrací ve SpeedVac. Pro nucené degradace byly použity oxidační a pH podmínky.

Instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution (1. dimenze: HILIC, Agilent ZORBAX RRHD 300-HILIC, 2.1×100 mm; 2. dimenze: RPLC, ZORBAX Eclipse Plus C18, 4.6×50 mm)
• Modulace: dva 40 µL smyčkové ventily, kokurentní zapojení, modulční čas 0,45 min
• Detekce UV/DAD: 280 nm, referenční 400 nm, diodový array
• MS: Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF, pozitivní ESI, Jet Stream, rozlišení ~10 000 @ m/z 1000
• Softwarové prostředí: OpenLab CDS Chemstation 2D-LC add-on, MassHunter Bioconfirm, GC Image LC×LC

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledný 2D-LC×LC konturový chromatogram pro trastuzumab ukázal více než 100 separovaných peptidů s vynikající ortogonalitou HILIC vs. RPLC. Díky on-line modulaci a splitu před MS detekcí bylo možné dosáhnout vysoké citlivosti a zachovat dlouhodobou stabilitu zdroje. Vzorky podrobené oxidačnímu a pH stresu odhalily nízkoúrovňové modifikace již v „nestresovaném“ stavu (metioninová oxidace) a umožnily izolaci deamidovaných forem (zpravidla nerozlišitelných v jednorozměrné RPLC).

Přínosy a praktické využití metody

Implementace HILIC×RPLC-MS přináší:

• dramatické navýšení kapacity a rozlišení u složitých peptidových směsí
• citlivou detekci nízkohladinových modifikací (oxidace, deamidace, neúplné štěpení)
• efektivní nástroj pro QC, stabilitu a srovnávací studie biosimilars
• zkrácení doby analýzy díky on-line 2D-konfiguraci

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se očekává ve směru plné automatizace 2D-LC×LC pracovních postupů a integrace pokročilých algoritmů pro zpracování konturových map. Kombinace s vysokorychlostními HRMS zdroji a multi-omics přístupy otevře nové možnosti aplikace v personalizované medicíně a vývoji biotherapeutik.

Závěr

Systém Agilent 1290 Infinity 2D-LC spojený s Q-TOF MS úspěšně rozšiřuje schopnosti peptidového mapování monoklonálních protilátek. Metoda nabízí robustní, vysoce ortogonální rozlišení a citlivou identifikaci modifikací, což je zásadní pro detailní charakterizaci a kontrolu kvality biopharma produktů.

Reference

1. Sandra K. a kol. The power of liquid chromatography-mass spectrometry in the characterization of protein biopharmaceuticals. LCGC Europe Supplement, May 2013.
2. Francois I., Sandra K., Sandra P. Comprehensive liquid chromatography: fundamental aspects and practical considerations – a review. Anal. Chim. Acta 2009, 64, 14–31.
3. Sandra K. a kol. Highly efficient peptide separations in proteomics. Part 2: bi- and multidimensional liquid-based separation techniques. J. Chromatogr. B 2009, 877, 1019–1039.
4. Zhu A., Martosella J., Duong P.T. Peptide mapping of glycoprotein erythropoietin by HILIC LC/MS and RP-LC/MS. Agilent Technologies, Application Note 2013, 5991-2085EN.
5. D’Attoma A., Heinisch S. On-line comprehensive two dimensional separations of charged compounds using reversed-phase HPLC and HILIC. Part II: application to peptides. J. Chromatogr. A 2013, 1306, 27–36.
6. Vanhoenacker G. a kol. Analysis of monoclonal antibody digests with the Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution. Agilent Technologies, Application Note 2013, 5991-2880EN.