Method Development in Comprehensive 2D-LC

Význam tématu

Reverzní fáze 2D-LC kombinace nabízí podstatné zvýšení separační schopnosti při analýze komplexních matic díky výrazně vyššímu počtu rozlišených látek ve srovnání s jednorozměrnou LC cestou. Optimalizace ortogonality mezi oběma dimenzemi je klíčová pro maximální využití potenciálu dvourozměrných způsobů.

Cíle a přehled studie

Cílem předloženého technického přehledu bylo vyvinout komplexní 2D-LC metodu založenou na RPLC v obou dimenzích, která dosáhne co nejvyššího pokrytí dvourozměrného separačního prostoru. Pro tento účel byl analyzován komplexní vzorek obsahující 70 modelových sloučenin napříč několika třídami.

Použitá instrumentace

• Dvoudimenziální LC Agilent Infinity II 2D-LC se dvěma vysokorychlostními pumpami s ventily pro výběr 13 solventů
• Multisloupcový termostat s výběrem šesti kolonek
• Diode array detektory pro UV měření ve dvou cestách
• Přepínací ventily s 80 μl modulačními smyčkami
• Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS s elektrospray ionizací

Použitá metodika

Jednorozměrné screenování kolonek a mobilních fází proběhlo se šesti odlišnými RP materiály podle Hydrophobic Subtraction Modelu a různými kombinacemi organické složky, pH a pufrů. Vypočítala se korelace retenčních faktorů pro všechny dvojice a identifikovaly se nejortogonálnější páry. Následně byly testovány vybrané kombinace v reálné 2D-LC konfiguraci s vyhodnocením frakčního pokrytí separačního prostoru metodou Gilar–Stoll s volitelnou velikostí binů. Pro konečnou metodu byl implementován posunutý gradient ve druhé dimenzi pro zlepšení pokrytí a potlačení šíření frakcí.

Hlavní výsledky a diskuse

• Nejnižší korelace retenčních faktorů byla zjištěna pro kombinaci ZORBAX RRHT Eclipse PAH (pufr pH 5/methanol) a ZORBAX RRHD Eclipse Plus C8 (pufr pH 5/acetonitril) s R2 = 0,957
• Frakční pokrytí separačního prostoru v 2D s plným gradientem dosáhlo až 18,4 %
• Použitím posunutého gradientu ve druhé dimenzi se frakční pokrytí zvýšilo nad 50 % a separace dosáhla lepší ortogonality
• Potlačení šíření průběžných frakcí zůstalo na přijatelném minimu díky optimalizaci modulačních smyček

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje robustní analýzu složitých matic obsahujících široké spektrum látek, výrazně zvyšuje reálnou kapacitu separace a minimalizuje koeluce kritických párů sloučenin. Díky možnosti automatického screenování solventů a kolonek je metoda vhodná pro environmentální, farmaceutické a potravinářské aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s výpočetními algoritmy a umělou inteligencí pro automatizaci volby kolonek a gradientů
• Rozšíření na multimodální separace a detekce
• Aplikace v metabolomice, proteomice a průmyslové kvalitativní kontrole
• Další optimalizace gradientních strategií s více posunutými úseky pro maximalizaci separačního výkonu

Závěr

Navržená RPLC×RPLC metoda s vysoce ortogonálními sloupci a posunutým gradientem ve druhé dimenzi dosahuje nadstandardního pokrytí separačního prostoru a poskytuje praktický nástroj pro detailní analýzu komplexních vzorků.

Reference

1. Rutan W L Stoll D R Peck E M Thomas M C Welch C J Fractional coverage metrics based on ecological home range for calculation of the effective peak capacity in comprehensive two-dimensional separations J Chromatogr A 2012 1255 267 276
2. Li Y Zhao S Carr P W Practical considerations in comprehensive two-dimensional liquid chromatography systems LC×LC with reversed-phases in both dimensions Anal Bioanal Chem 2015 407 153 167
3. Vanhoenacker G Lipka E Sandra P Increasing Peak Capacity with the Agilent 1290 Infinity II 2D-LC Solution Agilent Technologies Technical Overview 2015
4. Giddings J C Two-dimensional separations concept and promise Anal Chem 1984 56 1258A 1264A
5. Carr P Stoll D Two-Dimensional Liquid Chromatography Principles Practical Implementation and Applications Agilent Technologies Primer 2015
6. Graesboll O Sellers P Stoll D R Carr P W Using the hydrophobic subtraction model to choose orthogonal columns for online comprehensive two-dimensional liquid chromatography J Chromatogr A 2014 1326 39 46
7. Allen P M Stoll D R Carr P W Impact of reversed phase column pairs in comprehensive two-dimensional liquid chromatography J Chromatogr A 2014 1361 169 177
8. Bassanese C et al Protocols for finding the most orthogonal dimensions for two-dimensional high performance liquid chromatography Talanta 2015 134 402 408
9. Gilar M Jakubíková P Ocádiz A Stoll D R Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography Anal Chem 2005 77 6426 6434
10. Davis J M Carr P W Rutan A Pierce M Dependence of effective peak capacity in comprehensive two-dimensional separations on the distribution of peak capacity between the two dimensions Anal Chem 2008 80 8122 8134
11. Li Y Schmitz O Use of shift gradient in the second dimension to improve the separation space in comprehensive two-dimensional liquid chromatography Anal Bioanal Chem 2013 405 6511 6517