Cell Culture Optimization Using an Agilent Bio-Monolith Protein A Column and LC/MS

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují klíčovou třídu biologických léků, přičemž glykozylace je jednou z nejdůležitějších kritických kvalitativních vlastností. U biosimilárních protilátek je nezbytné dosáhnout glykozylace odpovídající originální látce, aby byla zajištěna bezpečnost a účinnost léku.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo optimalizovat podmínky kultivace Čínských křečkovitých vaječníkových buněk (CHO) produkujících biosimilární trastuzumab tak, aby glykozylace odpovídala originálnímu produktu Herceptinu. Pracovní postup zahrnoval izolaci protilátky pomocí Bio-Monolith Protein A kolony, kvantifikaci titru a strukturní charakterizaci pomocí LC/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky supernatantu kultury CHO buněk byly naředěny pufrem Na2HPO4, centrifugovány a redukovány 10 mM TCEP po dobu jedné hodiny. Izolace protilátky probíhala na Agilent Bio-Monolith Protein A coloně při pH 7.4 pro vazbu a pH 2.8 pro eluaci. Následovala online desalinace a odření disulfidických vazeb v místě sběru frakcí. Analýza byla provedena na Agilent 1290 Infinity LC spojené s Agilent 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF MS v pozitivním ionizačním režimu.
Instrumentace

• Bio-Monolith Protein A columna 2.1 × 10 mm, průtok 1 mL/min, UV detekce 280 nm
• Agilent 1100 Series čerpadlo, autosampler a diode array detektor
• Agilent 1290 Infinity Binary Pump, Autosampler, Thermostat
• Agilent Jet Stream ESI Q-TOF UHD Accurate-Mass
• Software OpenLAB CDS ChemStation, MassHunter a BioConfirm

Hlavní výsledky a diskuse

Spektra dekonvoluovaných hmotností ukázala postupné zvyšování podílu glykoform G1F a G2F na úkor G0F a G0 s rostoucími koncentracemi galaktózy, uridinu a chloridu manganičitého. Nejvhodnější kompromis mezi zvýšenou galaktosylací a zachovaným titrem mAb byl nalezen při čtyřnásobných a osmónásobných dávkách doplňků. Absolutní titry protilátky se snížily při nejvyšších koncentracích doplňků, ale zůstaly v akceptovatelném rozsahu.

Přínosy a praktické využití metody

Rychlá selekce kulturních podmínek a online měření titru i strukturní integrity protilátky umožňují významné zkrácení vývojové doby biosimilárních výrobků a přesnou kontrolu kritických kvalitativních parametrů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření online analytických postupů pro vysokopropustné skríningy, integrace automatizovaných systémů kultivace a pokročilých datových analýz včetně strojového učení pro prediktivní optimalizaci glykozylace a dalších modifikací protilátek.

Závěr

Agilent Bio-Monolith Protein A columna ve spojení s LC/MS prokázala schopnost cíleně ovlivňovat glykozylaci biosimilárního trastuzumabu. Klíčové parametry kulturního média byly optimalizovány tak, aby glykozylace odpovídala specifikacím originátoru při zachování dostatečného titru pro klinický vývoj.

Reference

1. K Sandra, I Vandenheede, P Sandra. J Chromatogr A 1335 81 (2014)
2. European Medicines Agency online informace
3. E Dumont, I Vandenheede, P Sandra, K Sandra, J Martosella, P Duong, M Joseph. Cell Clone Selection Using the Agilent Bio-Monolith Protein A Column and LC/MS Application Note Agilent Technologies Inc Publication 5991-5124EN (2014)
4. Gene online informace
5. MJ Gramer et al. Biotechnol Bioeng 108 1591 (2011)