Cell Clone Selection Using the Agilent Bio-Monolith Protein A Column and LC/MS

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) se staly klíčovou třídou terapeutik v léčbě onkologických a autoimunitních onemocnění. S příchodem patentových uvolnění původních produktů se otevírá prostor pro vývoj biosimilars. Efektivní výběr buněčných klonů s vysokou produkcí a požadovanou strukturální kvalitou je zásadní pro úspěšný vývoj jak inovátorů, tak biosimilars.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat využití Agilent Bio-Monolith Protein A kolonky pro rychlé stanovení titru trastuzumab-biosimilars v kultivačních supernatantech CHO buněk a současně izolovat mikrogramové množství protilátky k detailní strukturní charakterizaci pomocí vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie (Q-TOF). Tento přístup podporuje rozhodování při výběru nejperspektivnějších klonů.

Použitá metodika

Vzorky supernatantů CHO buněk se po naředění v 50 mM Na2HPO4 pH 7,4 a centrifugaci 5 000 g/5 min injektovaly na Bio-Monolith Protein A kolonu. Vazba IgG probíhala při pH 7,4, eluce při pH 2,8. Frakce pro strukturní analýzu se redukovaly 10 mM TCEP při pokojové teplotě 1 h. Pro hmotnostní spektrometrii se použil online desalting, chromatografie v obrácené fázi s gradientem formátované kyselinou mravenčí ve vodě a acetonitrilu.

Použitá instrumentace

• Agilent 1100 Series Quaternary Pump (G1311A)
• Agilent 1100 Series Autosampler (G1313A)
• Agilent 1100 Series Diode Array Detector (G1315A)
• Agilent 1200 Infinity Analytical-scale Fraction Collector (G1364C)
• Agilent 1290 Infinity Binary Pump (G4220B), Autosampler (G4226A), Thermostat (G1330B)
• Agilent 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF s Agilent Jet Stream
• OpenLAB CDS ChemStation C01.05, MassHunter B05.01/B06.00, BioConfirm B06.00

Hlavní výsledky a diskuse

- Protein A chromatografie umožnila jasné rozlišení úrovně vazby a eluce trastuzumabu ze supernatantů i originátoru.
- Kalibrační křivka Herceptinu pro rozsah 0,02–2 mg/mL vykázala výbornou linearitu (R2 0,9999).
- Z 12 testovaných klonů se jako nejlepší ukázaly klony 9 a 10 s titry až 0,757 mg/mL.
- Všechna vysoce produktivní kmenová klony vykazovala identické molekulové hmotnosti light a heavy chain jako originátory (±0,5 Da).
- Glykanový profil byl kvalitativně totožný (G0F, G1F, G2F), kvantitativní zastoupení jednotlivých glykoform se mezi klony mírně lišilo.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý a selektivní screening klonů přímo ze supernatantu bez nutnosti předčištění
• Možnost kvantifikace mAb titru v typickém rozmezí CHO buněk
• Izolace analytických množství pro další MS analýzu nebo IEX, SEC, HIC
• Úspora času a materiálu v procesu vývoje inovátorů i biosimilars

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace kultivačních médií pro cílenou úpravu glykozylace
• Rozšíření metody na multiplexní screening různých mAb populací
• Integrace s automatizovanými platformami pro vysokou propustnost
• Využití v QC procesech pro sledování stability a homogenity výrobku

Závěr

Agilent Bio-Monolith Protein A kolona představuje efektivní nástroj pro selekci CHO klonů na základě titru a strukturní integrity trastuzumab-biosimilars. Kombinace rychlé chromatografie s vysokorozlišovací MS umožňuje komplexní charakterizaci a podporu rozhodování v rané fázi vývoje.

Reference

• K. Sandra, I. Vandenheede, P. Sandra. Journal of Chromatography A, 1335, 81 (2014).
• EMA – European Medicines Agency, webová stránka.
• Genentech, Inc. informace o produktu Herceptin.
• E. Dumont et al. Cell Culture Optimization Using an Agilent Bio-Monolith Protein A Column and LC/MS, Agilent Technologies Application Note 5991-5124EN (2014).