ION-PAIRING SYSTEMS FOR REVERSED-PHASE CHROMATOGRAPHY OF OLIGONUCLEOTIDES

Význam tématu

Analýza čistoty syntetických oligonukleotidů je klíčová pro biotechnologické a farmaceutické aplikace. Iontově párovaná reverzní fáze nabízí rychlé a vysoce rozlišené separace kompatibilní s hmotnostní spektrometrií, čímž zvyšuje efektivitu kontroly kvality a výzkumné rutiny.

Cíle a přehled studie

Studie se zabývá systematickým porovnáním různých iontově párovaných systémů (alkylaminy s odlišnou hydrofobicitou) pro separaci oligonukleotidů v reverzní fázi. Cílem bylo určit nejvhodnější modifikátory na základě kapacity špiček a kompatibility s MS detekcí u homopolymerních i heteropolymerních oligonukleotidů.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografické separace proběhly na Waters ACQUITY UPLC systému s C18 kolonkou OST (1,7 µm, 2,1×50 mm) při 60 °C
• Vzorky: homopolymerní oligo dT 15–35 merů (20 pmol na injekci) a heteropolymerní směs 24-mer, 19-mer, 14-mer
• Mobilní fáze: ekvimolární roztoky acetátu a vybraného aminu (pH ≈ 7), optimalizovaný obsah acetonitrilu pro řízení retence
• Modifikátory: TEA/HFIP, TEAA, DMBAA, TPAA, HAA
• Detekce: UV a hmotnostní spektrometrie pro hodnocení MS kompatibility

Hlavní výsledky a diskuse

• U homopolymerů 15–35 merů dosahují nejvyšší kapacity špiček HAA a TEA/HFIP, přičemž HAA spolu s DMBAA a TPAA poskytují lepší rozlišení než TEAA
• Kapacita špiček pro acetátové tampony klesá méně strmě s růstem délky řetězce než u TEA/HFIP
• Všechna acetátová činidla vykazují srovnatelnou odezvu v MS; TEA/HFIP poskytuje nejlepší citlivost
• U heteropolymerů vykazuje HAA nejpravidelnější retenci řízenou nábojem, následuje TPAA; vyšší obsah acetonitrilu minimalizuje hydrofobní efekty a podporuje nábojově řízenou separaci

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a efektivní alternativa k iontové výměnné chromatografii s výrazně kratší dobou analýzy
• Vysoká kompatibilita s hmotnostní spektrometrií umožňuje přesnou charakterizaci syntetických produktů
• Možnost volby modifikátoru a složení mobilní fáze pro optimalizaci rozlišení dle délky a složení oligonukleotidu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj nových iontově párovaných činidel s naladěnou hydrofobicitou a nábojovou interakcí
• Integrace s ultraresolucními MS přístroji pro detailní analýzu sekvenčních variací
• Miniaturizace a automatizace UPLC systémů pro vysokopropustné QC a pokročilé výzkumné aplikace
• Multimodální kolony pro separaci strukturálních izomerů a modifikovaných oligonukleotidů

Závěr

Volba iontově párovaného činidla významně ovlivňuje rozlišovací schopnost IP-RP chromatografie oligonukleotidů. HAA a TPAA nabízejí nejlepší výkon s pravidelnou retencí vhodnou pro rutinní IP-RP s MS detekcí, TEA/HFIP je optimální pro vysokou citlivost v MS. Správná kombinace činidla a obsahu organické fáze umožňuje rychlé, reprodukovatelné a vysoce rozlišené analýzy.

Reference

Ve zdrojovém textu nebyly uvedeny žádné literární odkazy.