New AdvanceBio Workflow: Glycan Mapping Columns, Sample Preparation, and Standards

Význam tématu

Analýza glykanů je klíčová pro charakterizaci bioterapeutik a biosimilárních molekul, kde složení a struktura oligosacharidových řetězců ovlivňují funkci, imunogenicitu a stabilitu proteinu. Vysoce přesné a reprodukovatelné mapování glykanů pomáhá zkrátit dobu vývoje, minimalizovat variabilitu a zajistit dodržení přísných regulačních požadavků.

Cíle a přehled studie / článku

Článek představuje end-to-end řešení Agilent AdvanceBio pro mapování N-vázaných glykanů značených 2-AB. Popisuje kompletní workflow zahrnující přípravu vzorku, chromatografickou separaci i referenční standardy s cílem dosáhnout vyšší rychlosti, rozlišení a reprodukovatelnosti oproti konkurenčním přístupům.

Použitá metodika a instrumentace

Postup obsahuje čtyři hlavní kroky:

• Deglycosylace glykoproteinu enzymem PNGase F, denaturace a pracovní očista.
• Značení uvolněných glykanů fluoroforem 2-AB (2-aminobenzamid), redukce a následné SPE čištění.
• Chromatografická separace na HILIC kolónách AdvanceBio glycan mapping (1.8 µm a 2.7 µm částice) při optimálních gradientních podmínkách.
• Detekce pomocí fluorescenčního detektoru (Ex 260 nm, Em 430 nm) případně hmotnostní spektrometrie.
  
  Použitá instrumentace:
  
  • UHPLC systémy Agilent 1290 Infinity a 1260 Infinity II Bio-Inert Quaternary LC.
  • AdvanceBio glycan mapping kolony (2.1×150 mm, 1.8 µm; 2.1×150 mm, 2.7 µm superficially porous).
  • SPE cartridge a 96well destičky pro čištění a přípravu vzorků.
  • Fluorescenční detektor Agilent FLD.

Hlavní výsledky a diskuse

Ve srovnání s konkurenčními sub-2 µm kolónami ukázaly AdvanceBio kolony o 40% rychlejší analýzu (<10 minut) při zachování nebo zlepšení rozlišení. Kolony s 2.7 µm částicemi umožňují provozné tlaky pod 400 bar, což rozšiřuje kompatibilitu s konvenčními HPLC přístroji. Agilent IgG a dextranové standardy potvrzují vysokou opakovatelnost retencí a výkonu systému.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow výrazně zkracuje dobu analýzy v laboratořích zaměřených na vývoj biotherapeutik a kontrolu kvality. Díky kompletnímu řešení (kolony, připravné sady, standardy) se zjednodušuje validace metody, zajišťuje konzistentní výkon a minimalizují chyby při přesunech mezi laboratořemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rostoucí propojení s hmotnostní spektrometrií pro detailní strukturální charakterizaci, větší automatizace vzorkové přípravy v 96well formátu a vývoj nových sorbentů pro rozšířené glykanové analýzy, včetně O-glykanů a komplexních glykoproteomů.

Závěr

Agilent AdvanceBio glycan mapping nabízí moderní, plně integrované řešení, které rychle a spolehlivě mapuje N-vázané glycany značené 2-AB. Vysoké rozlišení, nízké provozní tlaky a připravené standardy umožňují zkrácení doby vývoje a zajištění konzistentních výsledků v biopharmaceutické praxi.

Reference

Agilent Technologies Application Note 5991-4730EN, 2015