AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE PROTEINU NA VÁZANÝCH KOVOVÝCH IONTECH

Význam tématu

Afinitní chromatografie na vázaných kovových iontech (IMAC) představuje klíčový nástroj pro rychlou, selektivní a efektivní purifikaci rekombinantních proteinů s fúzovanými histidinovými tagy. Umožňuje izolaci analyticky čistých proteinů z komplexních bakteriálních lyzátů i z nerozpustných inkluzních tělísek, čímž řeší jednu z hlavních překážek ve výzkumu a průmyslové aplikaci proteinů.

Cíle a přehled článku

Článek popisuje historický vývoj a princip IMAC, zdůrazňuje optimalizaci chelátorů (IDA, NTA) a kovových iontů (Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn2+), uvádí možnosti jednorázové purifikace za nativních i denaturačních podmínek a představuje aplikace metody v proteinovém inženýrství.

Použitá metodika a instrumentace

IMAC využívá agarosové nebo jinak modifikované chromatografické matrice s vázanou iminodioctovou (IDA) nebo nitrilotrioctovou (NTA) kyselinou, která koordinuje přechodné kovy. Běžně se používají kationty niklu, kobaltu či mědi. Systémy jsou provozovány na HPLC nebo FPLC aparaturách s možností regulace pH a iontové síly. Eluce probíhá gradientem imidazolu, změnou pH nebo EDTA.

Hlavní výsledky a diskuse

IMAC dokáže v jedné chromatografické separaci dosáhnout vysoké čistoty rekombinantních proteinů s 6–10 histidiny. Metoda je přizpůsobitelná:

• nativní purifikace při pH 7–8 s 0,5–1 M NaCl pro potlačení elektrostatických interakcí,
• denaturační režim s 6 M guanidinium chloridem nebo močovinou pro solubilizaci inkluzních tělísek,
• renaturace vázaných proteinů gradientem nebo pulsními vstupy denaturačního činidla.

Diskutována je výměna IDA za NTA kvůli vyšší stabilitě Ni–chelátu a selektivitě, význam optimalizace imidazolového gradientu a eliminace kontaminujících bakteriálních proteinů s histidinovými zbytky.

Přínosy a praktické využití metody

IMAC nabízí:

• jednostupňovou purifikaci s minimálními ztrátami biologické aktivity,
• možnost izolovat i labilní a inkluzní proteiny,
• snadnou regeneraci matrice a opakované použití,
• rozšíření o purifikaci protilátek, enzymových substrátů a dalších interagujících molekul.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se vývoj speciálních bakteriálních kmenů chudých na histidinové kontaminanty a nových chelátorů kombinujících efekty NTA a IDA s dalšími ligandovými skupinami. Dále jsou plánovány konstrukce víceúčelových fúzovaných domén pro jemnější řízení afinity, selektivity i podmínek renaturace na kolóně.

Závěr

IMAC se etablovala jako základní technika purifikace rekombinantních proteinů díky své univerzálnosti, vysoké čistotě a možnosti práce za nativních i denaturačních podmínek. Je klíčovým nástrojem akademického i průmyslového výzkumu proteinů.

Reference

1. Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J.J., Dubendorff J.W.: Methods Enzymol. 185, 60 (1990).
2. Kroll D.J. et al.: DNA Cell Biol. 12, 441 (1993).
3. Takahara M. et al.: J. Biol. Chem. 260, 2670 (1985).
4. Oka T. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7212 (1985).
5. Nilsson B., Abrahmsen L., Uhlén M.: EMBO J. 4, 1075 (1985).
6. Smith D.B., Johnson K.S.: Gene 67, 31 (1988).
7. LaVallie E.R. et al.: Bio/Technology 11, 187 (1993).
8. Porath J. et al.: Nature 258, 598 (1975).
9. Hochuli E. et al.: Bio/Technology 6, 1321 (1988).
10. Witner M.R. et al.: Arch. Biochem. Biophys. 318, 430 (1995).
11. Hochuli E., Dobeli H., Schacher A.: J. Chromatogr. 411, 177 (1987).
12. Ljungquist C. et al.: Eur. J. Biochem. 186, 563 (1989).
13. Beers E.P., Callis J.: J. Biol. Chem. 268, 21645 (1993).
14. Aniskovitch L.P., Winkler H.H.: Microbiology 142, 901 (1996).
15. Stoeckel J. et al.: J. Biol. Chem. 269, 29571 (1994).
16. Newton D.L. et al.: J. Biol. Chem. 269, 26739 (1994).
17. Shi P.Y. et al.: Bio/Techniques 23, 1036 (1997).
18. Etzerodt M. et al.: WO 94/18227 (1994).
19. Wulfing C. et al.: J. Biol. Chem. 269, 2895 (1994).