POKROČILÉ METODY STUDIA VZÁJEMNÝCH INTERAKCÍ PROTEINŮ S DNA

Význam tématu

Studium vzájemných interakcí proteinů s DNA je klíčové pro pochopení buněčných procesů jako replikace, transkripce, rekombinace a oprav poškozené DNA. Poruchy těchto interakcí mohou vést k závažným onemocněním, včetně nádorů, a jsou také využívány viry během jejich životního cyklu. Pokročilé metodiky umožňují nejen identifikaci de novo DNA-vazebných proteinů, ale i detailní charakterizaci jejich funkce a dynamiky v buňce.

Cíle a přehled článku

Tento článek shrnuje současné přístupy k izolaci a identifikaci DNA-vazebných proteinů, včetně:

• DNA-afinitní chromatografie kombinované s kvantitativní proteomikou a hmotnostní spektrometrií,
• gelové retardační analýzy (EMSA) a jejích modifikací,
• fluorescenční mikroskopie pro přímé i nepřímé sledování komplexů DNA–protein.

Popisuje principy, klíčové kroky, výhody a nevýhody jednotlivých technik a jejich potenciální aplikace v biologickém výzkumu.

Použitá metodika a instrumentace

Hlavní metodické prvky a instrumentace:

• Imobilizace specifických DNA ligandů (biotin–streptavidin) na pevné nosiče či magnetické částice,
• optimalizace vazebných a promývacích podmínek (pufry, kompetitory, soli, ionty, detergenty),
• eluce zachycených proteinů (solné, detergentní pufry, biotin, restrikční enzymy),
• příprava vzorků pro proteomiku: in-gel a in-solution digestion, StageTip/C18 čistění,
• LC-MS/MS analyzátory pro identifikaci a kvantifikaci proteinů (SILAC, chemické značení),
• elektroforetická zařízení pro EMSA a SDS-PAGE/2D ELFO,
• fluorescenční mikroskopy pro FRET, imunofluorescenci, GFP-fúze, chromobody a živé buňky (live cell imaging).

Hlavní výsledky a diskuse

DNA-afinitní chromatografie v kombinaci s kvantitativní proteomikou umožňuje selektivní a citlivou identifikaci jak abundentních, tak i minoritních DNA-vazebných proteinů. Izotopové značení (SILAC, chemické tagy) poskytuje relativní poměry specificky versus nespecificky vázaných proteinů. EMSA potvrzuje přímé vazby a při optimální renaturaci umožňuje stanovit MW a pI nových proteinů. Fluorescenční mikroskopie odhaluje dynamiku lokalizace proteinů v jádře, změny při poškození DNA a potvrzuje vazbu technikou FRET či chromobody. Kombinací těchto přístupů lze dosáhnout robustního workflow od izolace přes identifikaci až po funkční vysvětlení role DNA-vazebných proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

• De novo identifikace a charakterizace transkripčních faktorů a dalších DNA-vazebných proteinů,
• analýza vlivu stresových či léčebných podmínek na interakce protein–DNA,
• screening proteinů asociovaných se specifickými regulačními sekvencemi,
• podpora vývoje cílených terapií ovlivňujících modifikovatelné interakce DNA–protein.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj vyšší citlivosti a rychlosti hmotnostní spektrometrie, nové izotopové a chemické značení, automatizace DNA-afinitních workflow a pokročilé mikroskopické techniky (super-resolution, correlative light-electron microscopy) otevřou cestu ke studiu protein–DNA interakcí v jediném kroku a přímo v živé buňce. Integrace dat z proteomiky, genomiky a bioinformatiky zvýší přesnost predikcí vazebných míst a umožní systé­mové mapování regulačních sítí.

Závěr

Kombinace DNA-afinitní chromatografie, kvantitativní proteomiky, EMSA a fluorescenční mikroskopie představuje ucelený přístup k isolaci, identifikaci a funkční charakterizaci DNA-vazebných proteinů. Tyto metody se vzájemně doplňují a umožňují komplexní pohled na protein–DNA interakce v konte­xu buněčné signalizace a regulace.

Reference

• Boulon S, Westman BJ, Hutten S, Boisvert FM, Lamond AI. Mol Cell. 2010;40:216.
• Krupovic M, Forterre P. Ann N Y Acad Sci. 2015;1341:41.
• Furey TS. Nat Rev Genet. 2012;13:840.
• Woo AJ, Dods JS, Susanto E, Ulgiati D, Abraham LJ. Mol Cell Proteomics. 2002;1:472.
• Mittler G, Butter F, Mann M. Genome Res. 2009;19:284.
• Makowski MM, Willems E, Fang J, Choi J, Zhang T, Jansen PW, Brown KM, Vermeulen M. Proteomics. 2016;16:417.
• Casas-Vila N, Scheibe M, Freiwald A, Kappei D, Butter F. BMC Genomics. 2015;16:965.
• Béresová L, Veselá E, Chamrad I, et al. J Proteome Res. 2016;15:4505.
• Dey B, Thukral S, Krishnan S, Chakrobarty M, Gupta S, Manghani Ch, Rani V. Mol Cell Biochem. 2012;365:279.
• Berthelot V, Mouta-Cardoso G, Hégarat N, et al. Nucleic Acids Res. 2016;44:4721.
• Meng Z, Camalier CE, Lucas DA, Veenstra TD, Beck GR Jr, Condrads TP. J Proteome Res. 2006;5:1931.
• Lu X, Beck GR Jr, Gilbert LC, et al. J Bone Miner Res. 2011;26:209.
• Gadgil H, Jurado LA, Jarrett HW. Anal Biochem. 2001;290:147.
• O’Neill D, Yang J, Erdjument-Bromage H, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:349.
• Yaneva M, Tempst P. Methods Mol Biol. 2006;338:291.
• Dobretsova A, Johnson JW, Jones RC, Edmondson RD, Wight PA. J Neurochem. 2008;105:1979.
• Kumar NV, Bernstein LR. Anal Biochem. 2001;299:203.
• Drewett V, Molina H, Millar A, Müller S, von Hesler F, Shaw PE. Nucleic Acids Res. 2001;29:479.
• Yaneva M, Tempst P. Anal Chem. 2003;75:6437.
• Hirsch JD, Eslamizar L, Filanoski BJ, Malekzadeh N, Haugland RP, Beechem JM. Anal Biochem. 2002;308:343.
• Shevchenko A, Tomas H, Havlis J, Olsen JV, Mann M. Nat Protoc. 2006;1:2856.
• Šebela M, Stosová T, Havliš J, et al. Proteomics. 2006;6:2959.
• Rappsilber J, Mann M, Ishihama Y. Nat Protoc. 2007;2:1896.
• Chen X, Wei S, Ji Y, Guo X, Yang F. Proteomics. 2015;15:3175.
• Chahrour O, Cobice D, Malone J. J Pharm Biomed Anal. 2015;113:2.
• Hübner NC, Bird AW, Cox J, et al. J Cell Biol. 2010;189:739.
• UniProt Consortium. Nucleic Acids Res. 2010;38:D142.
• Szklarczyk D, Franceschini A, Wyder S, et al. Nucleic Acids Res. 2015;43:D447.
• Licata L, Orchard S, Amendolia A, et al. Methods Mol Biol. 2016;1415:55.
• Helmann LM, Fried MG. Nat Protoc. 2007;2:1849.
• Pagano JM, Clingman CC, Ryder SP. RNA. 2011;17:14.
• Holden NS, Tacon CE. J Pharmacol Toxicol Methods. 2011;63:7.
• Fried MG, Bromberg JL. Electrophoresis. 1997;18:6.
• Steiner S, Pfannschmidt T. Methods Mol Biol. 2009;479:273.
• Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Physiol Rev. 2010;90:1103.
• Maier J, Traenkle B, Rothbauer U. Cancer Res. 2016;76:5592.
• Blouin S, Craggs TD, Lafontaine DA, Penedo JC. Methods Mol Biol. 2009;543:475.
• Bennett BT, Bewersdorf J, Knight KL. Methods. 2009;48:63.
• Britton S, Coates J, Jackson SP. J Cell Biol. 2013;202:579.
• Mistrik M, Vesela E, Fürst T, et al. Sci Rep. 2016;6:19567.