Automated Preparation and LC-MS/MS Analysis of Methylmalonic Acid in Serum Using the Andrew+ Pipetting Robot and Xevo TQ-S micro

Význam tématu

Analýza methylmalonové kyseliny v séru je klíčovým nástrojem pro přesné určení stavu vitaminu B12. Obvykle mohou mít pacienti s nedostatkem B12 normální až zvýšené hladiny vitaminu v séru, proto je methylmalonová kyselina spolehlivějším biomarkerem. Využití LC-MS/MS umožňuje vysokou citlivost, selektivitu a průtok vzorků, což je nezbytné pro klinický výzkum a rutinní diagnostiku.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo přenést existující manuální postup přípravy vzorků pro stanovení MMA na automatizovaný systém Andrew+. Studie hodnotí:

• Snadnost implementace protokolu do cloudové platformy OneLab
• Reprodukovatelnost a přesnost automatizované přípravy
• Srovnání výkonnosti automatizace s manuálním zpracováním
• Zvýšení průtoku pomocí 96-well formátu

Použitá instrumentace

• Andrew+ pipetovací robot s cloudovým softwarem OneLab
• Ostro 96-well Plate pro precipitaci proteinů a odstranění fosfolipidů
• Vacuum+ zařízení pro filtraci extraktů
• ACQUITY UPLC I-Class System
• ACQUITY UPLC CSH C18, 1,7 μm kolona
• Xevo TQ-S micro tandemový kvadrupólový hmotnostní spektrometr

Použitá metodika

Vzorky séra prošly na destičce Ostro precipitací proteinů a adsorpcí fosfolipidů. Andrew+ zajišťoval:

• Přesný přenos reagencií a vzorků do 96-well destiček
• Pipetní míchání místo vortexu s optimalizovanými rychlostmi
• Filtraci pod Vacuum+ a následné odpaření eluátu mimo pracovní plochu
• Rekonstrukci vzorků a jejich odeslání do UPLC-MS/MS

Analýza byla provedena v režimu MRM na kolone CSH C18 při standardních provozních podmínkách UPLC a hmotové spektrometrie.

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaný protokol vykázal vynikající přesnost i přes srovnání s manuálním zpracováním:

• Preciznost ≤ 3,5 % (automatizace) vs. ≤ 5,2 % (manuální) v obou úrovních QC
• Rozdíl v procentuálním výtěžku (recovery) mezi metodami menší než 4 %

Nastavení parametrů liquid handlingu na Andrew+ přišlo klíčové pro dosažení konzistentních výsledků. Díky uživatelským výzvám a dělení protokolu na dvě části lze minimalizovat prostoje robota a zvýšit efektivitu práce.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace přípravy vzorků přináší:

• Výraznou úsporu času kvalifikovaného pracovníka
• Opakovatelnost výsledků a snížení rizika lidské chyby
• Snadné přenesení protokolu mezi laboratořemi díky cloudové platformě
• Možnost vysokoprůtokového zpracování až 96 vzorků najednou

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizované platformy pro přípravu vzorků budou nadále rozšiřovat svůj rozsah o další malé molekuly a biomarkery. Předpokládá se integrace on-deck odpařovacích modulů, plná konektivita s LIMS, využití umělé inteligence pro optimalizaci liquid handlingu a adaptace na různé biologie matice.

Závěr

Protokol automatizované přípravy MMA na systému Andrew+ byl úspěšně implementován a prokázal vynikající přesnost i srovnatelné výtěžnosti s manuálním postupem. Výsledná metoda umožňuje spolehlivou a efektivní podporu klinického výzkumu biomarkerů vitaminu B12.

Reference

1. Vashi P., Edwin P., Popiel B., Lammersfeld C., Gupta D. Methylmalonic Acid and Homocysteine as Indicators of Vitamin B-12 Deficiency in Cancer. PLoS ONE. 2016;11(1):e0147843.
2. Foley D., Van Hulle M., Brown H.A., Calton L.J. Analysis of Methylmalonic Acid in Serum Using the Xevo TQ-S micro for Clinical Research. Waters Application Note 720006806. 2020.