Accurate LC-MS Bioanalytical Quantification of Itaconic Acid Using the Automated Andrew+ Pipetting Robot for Ostro Sample Preparation

Význam tématu

Automatizace přípravy vzorků je klíčová pro zvýšení přesnosti, reprodukovatelnosti a efektivity bioanalytických LC-MS metod. Ruční manipulace je často zdrojem chyb v pipetování, ředění a čištění vzorků, což může negativně ovlivnit kvantifikaci nízkokoncentrovaných analytů v biologických matricích. Nasazení robotizovaných liquid-handling systémů přináší standardizaci, zkrácení doby práce a minimalizaci variability mezi operátory.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo demonstrovat schopnost pipetovacího robota Andrew+ plně automatizovat přípravu a extrakci itakonové kyseliny z lidské plazmy pomocí Ostro 96-well kazety pro precipitaci proteinů a odstraňování fosfolipidů. Následná kvantifikace byla prováděna LC-MS/MS na systému ACQUITY PREMIER v kombinaci s trojčíselným kvadrupólovým detektorem Xevo TQ-S micro.

Použitá instrumentace

• Automatizovaný pipetovací robot Andrew+ s cloud-native softwarem OneLab
• Waters Ostro Protein Precipitation & Phospholipid Removal 96-well Plate
• LC systém ACQUITY PREMIER s upravenou povrchovou chelací kolony
• Mass spektrometr Xevo TQ-S micro
• Nitrogenový výparník pro sušení vzorků

Použitá metodika

Na rozdíl od manuálního workflow robot Andrew+:

• Automaticky nastavil standardní křivku v rozsahu 0,5–100 ng/ml a QC vzorky (0,75; 7,5; 75 ng/ml)
• Smíchal plazmu s protein-disrupčním činidlem a aplikoval vakuu při ‑5 psi po dobu 5 minut
• Upozornil operátora na přenesení precipitátu do výparníku a následné obnovení vzorku zpět na paletu robota
• Rekonsitituoval vysušené vzorky a připravil je pro LC-MS/MS analýzu

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaný protokol dosáhl oproti manuální přípravě vyšších procentuálních výtěžků QC vzorků (100 % vs. nižší manuální hodnota) a lepších RSD hodnot. Intra-denní přesnost kvality kontroly se pohybovala mezi 104,9–112,8 % a RSD mezi 1,3–3,6 %. Linearita metody byla potvrzena hodnotou R2 = 0,997 na 200násobném dynamickém rozsahu.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace pipetování a extrakce:

• Snižuje operátorské chyby a mezi­uživatelskou variabilitu
• Umožňuje paralelní zpracování až 96 vzorků
• Volní ruky laboratoře pro jiné úlohy během běhu metody
• Zajišťuje přenositelnost metod mezi pracovišti díky uloženým protokolům v OneLab

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace umělé inteligence pro optimalizaci protokolů a predikci chyb Příprava komplexních multiplexních panelů biomarkerů Rozšíření automatizace o on-line detekční prvky Vyšší throughput s minimalizovanou spotřebou reagencií Adaptace metody na další biologické matrice a nekonvenční vzorky

Závěr

Robot Andrew+ v kombinaci s Ostro PPT a fosfolipidovým odstraňováním prokázal vynikající výkon v přípravě vzorků pro LC-MS kvantifikaci itakonové kyseliny. Automatizované workflow přineslo lepší výtěžky, nižší variabilitu a splnilo kritéria bioanalytické validace. Výsledný protokol představuje škálovatelné a přenosné řešení pro bioanalytické laboratoře.

Reference

1. Wells DA. Automation Tools and Strategies for Bioanalysis. In Progress in Pharmaceutical and Biomedical Analysis; Elsevier, 2003; p. 135–197.
2. Brennan K, Trudeau M. Bioanalytical LC-MS Quantification of Itaconic Acid: A Potential Metabolic Biomarker of Inflammation. Waters Application Note 720006683, 2019.
3. Bansal S, DeStefano A. Key Elements of Bioanalytical Method Validation for Small Molecules. The AAPS Journal 2007, 9(1), E109–E114.