Strategies for Improving Impurity Isolation Using Large Volume Loading and Easy Method Development in Preparative Chromatography

Význam tématu

Správná identifikace a izolace nečistot v produktech farmaceutického, agrochemického či potravinářského průmyslu je zásadní pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a souladu s regulacemi. Preparativní chromatografie s využitím technik velkého objemu vzorku, gradientového zaostření a hmotnostně řízené purifikace umožňuje rychlou a efektivní separaci kontaminantů bez nutnosti časově náročné syntézy standardů.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje integraci čtyř hlavních strategií: naložení velkého objemu vzorku, zaostřený gradient, změnu selektivity pomocí sekundární kolony a hmotnostně řízenou purifikaci. Modelovým vzorkem byla zelený čaj, z něhož byly izolovány hlavní katechiny epigallocatechin gallate (EGCG) a nečistota epicatechin gallate (ECG).

Použitá instrumentace

• Waters AutoPurification System (2545 Binary Gradient Module, 2767 Sample Manager, System Fluidics Organizer, 8–30 mL flow splitter, 2×515 HPLC pump, 2998 PDA detektor, ACQUITY QDa detektor)
• Waters OBD Prep Columns: XBridge BEH Shield RP18 (4,6×50 mm a 19×50 mm) a XBridge Phenyl (4,6×50 mm a 19×100 mm)
• At-Column Dilution

Použitá metodika

Vzorek zeleného čaje extrahovaný horkou vodou byl injikován analytickou kolonu (4,6×50 mm) i preparativní kolonu (19×50 mm) s mobilní fází 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě (A) a v acetonitrilu (B). Pro screening se aplikoval gradient 5–50 % B za 5 min, pro purifikaci zaostřený gradient 21–29 % B za 4,5 min. Hmotnostní detekce probíhala v módu ES+, m/z 100–650, s ACQUITY QDa detektorem.

Hlavní výsledky a diskuse

Při osmi injekcích velkého objemu (100 mL) byl získán frakční pool m/z 443,2 se 77 % čistotou. Zaostřením gradientu na RP18 kolonu se čistota zvýšila na 94 %. Další změnou na XBridge Phenyl a optimalizovaným gradientem (18–26 % B) přišlo ke zlepšení rozlišení, což vedlo k izolaci ECG s 100 % čistotou.

Přínosy a praktické využití metody

Postup minimalizuje počet běhů a spotřebu rozpouštědel, zkracuje dobu vývoje metody a zjednodušuje izolaci nečistot bez nutnosti syntézy standardních látek. Hmotnostně řízená purifikace zaručuje výběr přesných frakcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Popsané strategie lze aplikovat na izolaci nečistot v širokém spektru matric, včetně farmaceutik, agrochemikálií a přírodních produktů. Dalším krokem je integrace s superkritickou kapalinovou chromatografií, automatizace přenosu frakcí a využití pokročilých detektorů.

Závěr

Kombinace velkého objemu vzorku, gradientového zaostření, změny selektivity kolony a hmotnostně řízené purifikace představuje efektivní a snadno implementovatelný přístup k izolaci a purifikaci nečistot s dosažením vysoké čistoty.

Reference

• ICH harmonized tripartite guideline, Impurities in new drug substances Q3A (R2), 25 October 2006.
• McCauley J, Twohig M. Isolating Trace Impurities for Structural Elucidation in a Commercial Fungicide Formulation Using Preparative SFC. Waters Application Note 720005374EN. 2015 April.
• Jones MD, Aubin A. Impurity Isolation and Scale-up from UPLC Methodology: Analysis of an Unknown Degradant Found in Quetiapine Fumarate. Waters Application Note 720003078EN. 2009 May.
• Wheat T, et al. At-Column Dilution Application Notes. Waters Application Note 71500078010rA. 2003.
• Jablonski JM, Aubin AJ, Harrop W. Techniques for Improving the Efficiency of Large Volume Loading in Preparative Liquid Chromatography. Poster PSTR134833678. 2015 March.
• Jablonski JM, Wheat TE, Diehl DM. Developing Focused Gradients for Isolation and Purification. Waters Application Note 720002955EN. 2009 September.
• Aubin A. Qualitative and Quantitative Analysis of Natural Products. Waters Application Note WA01015. Waters Performance PerSPECtives WPP303. 2000.
• Jablonski JM, Aubin AJ, Harrop W. Techniques for Improving the Efficiency of Large Volume Loading in Preparative Liquid Chromatography. Poster PSTR134833678. 2015 March.