Techniques for Improving the Efficiency of Large Volume Loading in Preparative Liquid Chromatography
Technické články | 2015 | WatersInstrumentace
Analytická preparativní tekutá chromatografie často čelí výzvě zpracování objemově velkých a slabě koncentrovaných vzorků. Efektivní naložení vzorku přímo ovlivňuje výtěžek, časovou náročnost a spotřebu rozpouštědel při izolaci cílových sloučenin z komplexních matric.
Cílem studie bylo porovnat a optimalizovat techniky velkoobjemového naložení vzorku ve slabém ředidle pro izolaci sloučenin z extraktu zeleného čaje. Klíčové složky cíle zahrnovaly zvýšení hmotnostního naložení, zachování chromatografické rozlišení a minimalizaci počtu běhů.
Pro screening a preparativní izolaci byly využity tyto přístroje:
Mobilní fáze tvořila voda a acetonitril, oba s 0,1 % formovou kyselinou. Vzorek (extrakt ze sáčků zeleného čaje) byl připraven horkou vodou, filtrovaný a ředěný v poměru 50 : 50 voda : acetonitril pro makeup solvent.
1. Analytický screening s injekcí 200 µL prokázal dostatečné rozlišení epigalokatechin galátu (EGCG) a epikatechin galátu (ECG) pomocí hmotnostního detektoru.
2. Geometrické zvětšení objemu na preparativní koloně (3,4 až 6,8 mL) vedlo k průměrným čistotám EGCG 94 % a ECG 40–72 % bez úprav gradientu.
3. Použití fokusovaného gradientu na 6,8 mL injekci zvýšilo čistotu na 100 % pro EGCG a 80 % pro ECG.
4. Naložení 21 mL vzorku smíchaného v tee pomocí pumpy při 25 mL/min udrželo čistoty srovnatelné s menšími objemy (EGCG 95 %, ECG 80–92 %).
5. Zvýšení objemu na 40 a 100 mL pomocí pumpovacího naložení vedlo k dalšímu snížení počtu běhů a spotřeby rozpouštědel, přičemž čistoty EGCG zůstaly nad 95 % a ECG kolem 70–80 %.
Metody pumpovacího naložení a at-column dilution umožňují zpracování vyšších objemů slabých roztoků bez zásadního zhoršení rozlišení. Hmotnostně řízená frakcionace jednoznačně identifikuje eluci cílové sloučeniny a usnadňuje zachytávání frakcí i při velkém zatížení kolony.
Modifikace naložení vzorku pomocí pumpy a zaměřené gradienty významně zvyšují efektivitu preparativní chromatografie slabých roztoků. Kombinace hmotnostně řízené detekce a jednoduchých úprav systému snižuje počet běhů, spotřebu rozpouštědel i čas potřebný k izolaci vysoce čistých sloučenin.
LC/MS, LC/SQ, PrepLC
ZaměřeníPotraviny a zemědělství
VýrobceWaters
Souhrn
Význam tématu
Analytická preparativní tekutá chromatografie často čelí výzvě zpracování objemově velkých a slabě koncentrovaných vzorků. Efektivní naložení vzorku přímo ovlivňuje výtěžek, časovou náročnost a spotřebu rozpouštědel při izolaci cílových sloučenin z komplexních matric.
Cíle a přehled studie
Cílem studie bylo porovnat a optimalizovat techniky velkoobjemového naložení vzorku ve slabém ředidle pro izolaci sloučenin z extraktu zeleného čaje. Klíčové složky cíle zahrnovaly zvýšení hmotnostního naložení, zachování chromatografické rozlišení a minimalizaci počtu běhů.
Použitá metodika a instrumentace
Pro screening a preparativní izolaci byly využity tyto přístroje:
- Waters AutoPurification System se 2545 Binary Gradient Module, 2767 Sample Manager a 2998 PDA detektorem
- ACQUITY QDa detektor pro hmotnostně řízenou frakcionaci
- XBridge BEH Shield RP18 analytická kolona 4,6×50 mm a OBD Prep kolona 19×50 mm
- Dva 515 HPLC pumpy pro míchání mobilní fáze a pumpovací naložení vzorku (pump loading)
Mobilní fáze tvořila voda a acetonitril, oba s 0,1 % formovou kyselinou. Vzorek (extrakt ze sáčků zeleného čaje) byl připraven horkou vodou, filtrovaný a ředěný v poměru 50 : 50 voda : acetonitril pro makeup solvent.
Hlavní výsledky a diskuse
1. Analytický screening s injekcí 200 µL prokázal dostatečné rozlišení epigalokatechin galátu (EGCG) a epikatechin galátu (ECG) pomocí hmotnostního detektoru.
2. Geometrické zvětšení objemu na preparativní koloně (3,4 až 6,8 mL) vedlo k průměrným čistotám EGCG 94 % a ECG 40–72 % bez úprav gradientu.
3. Použití fokusovaného gradientu na 6,8 mL injekci zvýšilo čistotu na 100 % pro EGCG a 80 % pro ECG.
4. Naložení 21 mL vzorku smíchaného v tee pomocí pumpy při 25 mL/min udrželo čistoty srovnatelné s menšími objemy (EGCG 95 %, ECG 80–92 %).
5. Zvýšení objemu na 40 a 100 mL pomocí pumpovacího naložení vedlo k dalšímu snížení počtu běhů a spotřeby rozpouštědel, přičemž čistoty EGCG zůstaly nad 95 % a ECG kolem 70–80 %.
Přínosy a praktické využití metody
Metody pumpovacího naložení a at-column dilution umožňují zpracování vyšších objemů slabých roztoků bez zásadního zhoršení rozlišení. Hmotnostně řízená frakcionace jednoznačně identifikuje eluci cílové sloučeniny a usnadňuje zachytávání frakcí i při velkém zatížení kolony.
Budoucí trendy a možnosti využití
- Automatizace a integrace pumpovacích systémů pro kontinuální naložení vzorku
- Další optimalizace gradientů s adaptivními algoritmy pro maximální čistotu a výtěžek
- Rozšíření hmotnostně řízené frakcionace pro vícekanálové detektory s vysokým rozlišením
- Uplatnění metodiky u izolace bioaktivních látek z přírodních extraktů a farmaceutických prekurzorů
Závěr
Modifikace naložení vzorku pomocí pumpy a zaměřené gradienty významně zvyšují efektivitu preparativní chromatografie slabých roztoků. Kombinace hmotnostně řízené detekce a jednoduchých úprav systému snižuje počet běhů, spotřebu rozpouštědel i čas potřebný k izolaci vysoce čistých sloučenin.
Reference
- Wheat T. At-Column Dilution. Waters Application Note 71500078010rA, 2003.
- Jablonski J., Wheat T., Diehl D. Developing Focused Gradients for Isolation and Purification. Waters Technical Note 720002955EN, 2009.
Obsah byl automaticky vytvořen z originálního PDF dokumentu pomocí AI a může obsahovat nepřesnosti.
Podobná PDF
Strategies for Improving Impurity Isolation Using Large Volume Loading and Easy Method Development in Preparative Chromatography
2015|Waters|Aplikace
Strategies for Improving Impurity Isolation Using Large Volume Loading and Easy Method Development in Preparative Chromatography Jo-Ann M. Jablonski, Andrew J. Aubin, and Wendy Harrop Waters Corporation, Milford, MA, USA T ECHNOLOGY BENEFIT S ■■ The amount of impurity introduced…
Klíčová slova
isolation, isolationimpurity, impuritygallate, gallatexbridge, xbridgeepicatechin, epicatechinloading, loadinglarge, largeimproving, improvingphenyl, phenylpurification, purificationstrategies, strategiespreparative, preparativevolume, volumeselectivity, selectivitydirected
Mass-Directed Isolation of a Synthetic Peptide Using the ACQUITY QDa Detector
2015|Waters|Aplikace
Mass-Directed Isolation of a Synthetic Peptide Using the ACQUITY QDa Detector Jo-Ann M. Jablonski and Andrew J. Aubin Waters Corporation, Milford, MA, USA A P P L I C AT I O N B E N E F I T…
Klíčová slova
qda, qdapeptide, peptideacquity, acquitydirected, directedisolation, isolationsynthetic, syntheticmass, massdetector, detectorautopurification, autopurificationxselect, xselectshoulder, shouldercsh, cshpurification, purificationpeptides, peptidescollection
Improving Resolution and Column Loading Systematically in Preparative Liquid Chromatography for Isolating a Minor Component from Peppermint Extract
2013|Waters|Aplikace
Improving Resolution and Column Loading Systematically in Preparative Liquid Chromatography for Isolating a Minor Component from Peppermint Extract Jo-Ann M. Jablonski and Rui Chen Waters Corporation, Milford, MA, USA A P P L I C AT I O N B…
Klíčová slova
preparative, preparativesystematically, systematicallyxselect, xselectacd, acdloading, loadingcolumn, columncsh, cshautopurification, autopurificationimproving, improvingstrong, strongresolution, resolutionprep, prepsolvent, solventchromatography, chromatographypeppermint
Improving the Productivity in Isolating a Naturally Occurring Bioactive Compound Using Supercritical Fluid Extraction and Preparative Supercritical Fluid Chromatography
2015|Waters|Aplikace
Improving the Productivity in Isolating a Naturally Occurring Bioactive Compound Using Supercritical Fluid Extraction and Preparative Supercritical Fluid Chromatography John McCauley, Jo-Ann Jablonski, Andrew Aubin, and Rui Chen Waters Corporation, Milford, MA, USA A P P L I C AT…
Klíčová slova
sfc, sfcisolating, isolatingbioactive, bioactivenaturally, naturallyoccurring, occurringproductivity, productivityscan, scanisopropanol, isopropanolsfe, sfeimproving, improvingdiode, diodearray, arraytime, timemin, minnitro
