Mass-Directed Isolation of a Synthetic Peptide Using the ACQUITY QDa Detector

Význam tématu

Peptidové sloučeniny představují důležitou třídu kandidátů v moderním vývoji léčiv díky své vysoké specifitě, stabilitě a nízké imunogenicitě. Tradiční UV-řízená chromatografie často naráží na problémy s jednoznačným odlišením cílového peptidu od vedlejších produktů syntézy a štěpení. Zavedení hmotnostně řízené izolace s detektorem ACQUITY QDa přináší jasnou identifikaci molekulových iontů v rozsahu 30–1250 Da, čímž se minimalizuje riziko zkřížených signálů a zvyšuje účinnost purifikace.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na vyvinutí jednoduchého, ale efektivního postupu pro izolaci hrubého syntetického peptidu o monoisotopické hmotnosti 1626,8 Da. Cílem bylo optimalizovat chromatografickou metodu kombinovanou s masově cílenou detekcí, aby bylo možné odlišit cílovou molekulu od různých vedlejších produktů vznikajících při syntéze a štěpení na pevné fázi.

Použitá metodika a instrumentace

Pro screening byly použity analytické kolony XBridge C18, SunFire C18 a XSelect CSH Phenyl-Hexyl. Mobilní fáze obsahovaly 0,1 % TFA ve vodě a v acetonitrilu. Pro přípravnou frakcionaci se aplikovala kolona XSelect CSH Phenyl-Hexyl OBD Prep (19×150 mm, 5 µm) s gradientem 16–24 % B ve 40,9 min. Detekce probíhala paralelně UV (220, 280 nm) a masově řízeným ACQUITY QDa Detector (ES+; m/z 100–1200; 2 Hz). Jako makeup solvent sloužily směsi 50:50 a 90:10 vody:acetonitrilu s 0,1 % kyselinou propionovou.

Hlavní výsledky a diskuse

Screening na SunFire a XBridge odhalil koelucující nečistoty, jejichž rozlišení se podařilo optimalizovat použitím selectivity kolony Phenyl-Hexyl a zjemněním gradientu až na 0,28 % změny na objem kolony. Geometrické přepočty ukázaly, že injekce 256 µL na přípravnou kolonu zachovává chromatografii analogicky analytické metodě. Masově řízený sběr frakcí na základě [M+3H]3+ (m/z 543,3) a [M+2H]2+ (m/z 814,4) vedl k izolaci vysoce čistého cílového peptidu. Srovnání různých makeup solventů prokázalo, že oba poměry (50:50 i 90:10) poskytují ostré signály, s lehce užšími píky při vyšší teplotě ionizačního zdroje u 90:10.

Přínosy a praktické využití metody

• Unambiguous atribuce cílového peptidu v komplexním směsném vzorku.
  
• Rychlá optimalizace syntézy a štěpení na základě identifikace vedlejších produktů.
  
• Zvýšení výtěžnosti a čistoty konečného produktu díky masové selektivitě sběru frakcí.
  
• Snížení nákladů díky použití kompaktního a cenově dostupného detektoru QDa.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření masově řízených purifikačních systémů v kombinaci s pokročilou mikrofrakcí a automatizací. Integrace detekce s průmyslovými LIMS a on-line sledováním kvality umožní v reálném čase upravovat syntetické procesy. Další výzvou je adaptace metody na složitější peptidové deriváty, posttranslační modifikace a glykopeptidy s využitím modulárních kolonních systémů.

Závěr

Použití ACQUITY QDa Detektoru v AutoPurification systému přináší efektivní, jednoznačnou a vysoce čistou purifikaci syntetických peptidů. Metoda umožňuje rychlou optimalizaci chromatografie a syntetického postupu a přispívá k vyšší produktivitě a kvalitě při vývoji peptidových léčiv.

Reference

1. Uhlig T. et al. The emergence of peptides in the pharmaceutical business: From exploration to exploitation. EuPA OPEN PROTEOMICS 4 (2014) 58–69.
   
2. Fosgerau K., Hoffmann T. Peptide therapeutics: current status and future directions. Drug Discovery Today 20(1) (2015).
   
3. Merrifield R.B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85(14) (1963) 2149–2154.
   
4. Jablonski J., Wheat T., Diehl D. Developing Focused Gradients for Isolation and Purification. Waters Techn. Note 720002955EN (2009).