Mass-Directed Isolation of Synthetic Peptides Using the Waters SQ Detector 2

Význam tématu

Peptidy jsou stále častěji používány jako léčivé látky díky své specifické biologické aktivitě. Při jejich syntéze však vzniká řada vedlejších produktů a nečistot, které je nutné efektivně oddělit od cílového produktu. Tradiční UV-detektory nedokážou vždy jednoznačně identifikovat požadovaný peptid, což prodlužuje časy až náročné následné práce. Mass-directed izolace pomocí hmotnostního detektoru SQ Detector 2 na autočisticím systému umožňuje cílenou detekci peptidu podle jeho hmotnostního signálu, čímž zvyšuje efektivitu a snižuje počet frakcí pro další zpracování.

Cíle a přehled studie

Cílem práce je demonstrovat možnosti konfigurace detektoru SQ Detector 2 v systému Waters AutoPurification pro analýzu a purifikaci syntetických peptidů s m/z v rozmezí 2–3072 Da. Studie ukazuje, jak hmotnostní detekce pomáhá:

• snížit nejednoznačnost identifikace analytu,
• odhalit kontaminanty a optimalizovat syntetický protokol,
• zrychlit workflow díky automatizovanému sběru frakcí.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografie byla prováděna na analytických i preparativních kolonkách značky XBridge BEH (Phenyl a C18) s gradienty formovanými z 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě (A) a 0,1 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu (B). Průtok analyticky činil 1,46 mL/min, pro preparativní režim až 25 mL/min. Hmotnostní detekce v ionizačním režimu ES+ byla nastavena na rozsah 100–3072 amu, s kapilárními a vakuovými parametry optimalizovanými pro peptidové ionty. AutoPurification System zahrnoval moduly 2545 Binary Gradient, 2767 Sample Manager, 2998 PDA detektor, SQ Detector 2 a software FractionLynx pro sledování frakcí.

Hlavní výsledky a diskuse

Na modelovém peptidu B (14 aminokyselin, monoisotopická hmotnost 1322,7 Da) byla pro analýzu úspěšně aplikována technika focused gradientů s úpravou sklonu gradientu k rozlišení blízkých nečistot. Optimalizací sklonu z 0,67 % na 0,34 % změny na objem kolonky se výrazně zlepšilo rozlišení a umožnilo vyšší nálože při přepínání na preparativní režim. U biotechnologického 39-meru (průměrná hmotnost 4186,6 Da) byla použita at-column dilution pro větší objem injekce se zachováním vysoké čistoty ve sdružené frakci. Frakční analýza prokázala vysokou výtěžnost a čistotu produktu již po jedné sbírce.

Přínosy a praktické využití metody

Mass-directed izolace s SQ Detector 2:

• umožňuje bezchybnou identifikaci cílového peptidu,
• snižuje počet nepotřebných frakcí,
• urychluje celý proces purifikace,
• pomáhá odhalit vedlejší produkty a zpětně optimalizovat syntézu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření této technologie v biotechnologické výrobě peptidů a proteinů vyšších hmotností, integrace s pokročilými algoritmy pro samoadaptivní řízení gradientů a kombinace s dalšími detekčními technikami. At-column dilution lze dále zdokonalit pro extrémně nízké koncentrace peptidů a nasadit v kontinuálních procesních systémech.

Závěr

Waters AutoPurification System s SQ Detector 2 prokázal vysokou efektivitu mass-directed izolace syntetických peptidů v širokém m/z rozsahu. Kombinace focused gradientů, optimalizace nálože a automatického sběru frakcí výrazně zkracuje dobu purifikace a zvyšuje čistotu výsledných produktů.

Reference

1. De Spiegeleer B. et al. Implementation of a Single Quad MS Detector in Routine QC Analysis of Peptide Drugs. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2016;6:24–31.
2. Jad Y. et al. Oxyma-T, Expanding the Arsenal of Coupling Reagents. Tetrahedron Letters, 2016;57(31):3523–3525.
3. Uhlig T. et al. The Emergence of Peptides in the Pharmaceutical Business: From exploration to exploitation. EuPA OPEN PROTEOMICS, 2014;4:58–69.
4. Augusta University. Manmade Peptides Reduce Breast Cancer’s Spread. Technology Networks, 2017.
5. Oligos & Peptides. Chemistry Today, 2016;34(2).
6. Banerjee S., Mazumdar S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry: A Technique to Access the Information Beyond the Molecular Weight of the Analyte. International Journal of Analytical Chemistry, 2012;Article ID 282574.
7. Jablonski J. et al. Developing Focused Gradients for Isolation and Purification. Waters Technical Note 720002955EN, 2009.
8. Volmer D.A., Leslie A.D. Dealing With the Masses: A Tutorial on Accurate Masses, Mass Uncertainties, and Mass Defects. Spectroscopy, 2007;22(6).