Characterization of EPO N-Glycans using RapiFluor-MS and HILIC Profiling

Význam tématu

Erytropoetin (EPO) je vysoce glykosylovaný hormon zodpovědný za stimulaci tvorby červených krvinek. Heterogenita jeho N-glykánů významně ovlivňuje stabilitu, biologickou aktivitu a farmakokinetiku terapeutických forem. Detailní charakterizace glykanového profilu EPO je klíčová při vývoji biosimilárních produktů a kontrole kvality.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo zmapovat složité N-glykany rekombinantního lidského EPO (rhEPO) pomocí rychlého vzorkového přípravku GlycoWorks RapiFluor-MS a monodimenzionální HILIC-UPLC s online detekcí FLR a ESI-QTof MS. Studie demonstruje schopnost jednorozměrné separace nahradit dosavadní víceúrovňové chromatografické strategie.

Použitá metodika a instrumentace

Postup vzorkové přípravy trval 30 minut a zahrnoval enzymatické uvolnění N-glykánů a jejich značení:

• Surfaktant RapiGest SF pro denaturaci proteinu
• Rapid PNGase F při 50 °C pro rychlou deglycosylaci (5 minut)
• 5minutová reakce se značkou RapiFluor-MS pro zvýšení fluorescence a MS citlivosti
• Separace a čištění pomocí GlycoWorks HILIC µElution destičky

Analytická instrumentace:

• ACQUITY UPLC I-Class System s kolonkou Glycan BEH Amide (2.1×150 mm, 1.7 µm, 130 Å)
• Detekce fluorescence (FLR) a ESI-QTof MS (Xevo G2-S)
• Mobilní fáze: 50 mM formiát amonný (pH 4.4) a acetonitril, gradient 25–46 % vodné fáze, 35 minut, kolona 60 °C

Hlavní výsledky a diskuse

HILIC-FLR-MS chromatogramy vykázaly vysoký poměr signál/šum a umožnily identifikaci hlavních N-glykanů na základě přesné hmotnosti a předchozích dat:

• Tetraantennární glykany se 4 sialovými kyselinami (FA4G4S4) tvoří ~20 % celkové poolu
• Laktosaminové rozšíření: FA4G4Lac1S4 ~12 %, FA4G4Lac2S4 ~4,5 %
• Vzácněji FA4G4Lac3S4 ~0,75 % a FA4G4Lac4S4 ~0,25 %

Metoda nahradila dřívější dvourozměrné přístupy kombinující aniontovou výměnnou chromatografii a HILIC jednorozměrnou HILIC-UPLC s online MS detekcí, což výrazně zjednodušilo workflow.

Přínosy a praktické využití metody

RapiFluor-MS značení přineslo vyšší kvantové výtěžky fluorescence a lepší ionizační účinnost při ESI, což umožnilo:

• Rychlou a spolehlivou přípravu vzorku v rámci 30 minut
• Sensitivní detekci nízkomolekulárních i vysoce větvených glykanů
• Jednorozměrnou separaci složitých glykanových profilů

Tato metoda je vhodná pro rutinní kontrolu kvality a podporu vývoje biosimilárních EPO.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace automatizovaných vzorkových příprav, rozšíření metod pro O-glykany a propojení s multidimenzionálními systémy pro komplexní glykoprofiling. Dále bude klíčové využití v kontextu kvality procesů (QbD) a personalizované medicíny.

Závěr

Komplexní analýza N-glykanů rhEPO pomocí GlycoWorks RapiFluor-MS a HILIC-UPLC-QTof MS poskytuje rychlý, citlivý a jednodimenzionální přístup pro charakterizaci vysoce heterogenních glykanových profilů. Tato metoda nabízí významné zjednodušení workflow a podporuje rozvoj biosimilárních produktů.

Reference

• Dube S.; Fisher J. W.; Powell J. S. Glycosylation at specific sites of erythropoietin is essential for biosynthesis, secretion, and biological function. J Biol Chem 1988, 263(33), 17516–21.
• Sasaki H.; Bothner B.; Dell A.; Fukuda M. Carbohydrate structure of erythropoietin expressed in Chinese hamster ovary cells by a human erythropoietin cDNA. J Biol Chem 1987, 262(25), 12059–76.
• Hashii N.; Harazono A.; Kuribayashi R.; Takakura D.; Kawasaki N. Characterization of N-glycan heterogeneities of erythropoietin products by liquid chromatography/mass spectrometry and multivariate analysis. Rapid Commun Mass Spectrom 2014, 28(8), 921–32.
• Takeuchi M.; Inoue N.; Strickland T. W.; Kubota M.; Wada M.; Shimizu R.; Hoshi S.; Kozutsumi H.; Takasaki S.; Kobata A. Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells. Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86(20), 7819–22.
• Goldwasser E.; Kung C. K.; Eliason J. On the mechanism of erythropoietin-induced differentiation. 13. The role of sialic acid in erythropoietin action. J Biol Chem 1974, 249(13), 4202–6.
• Bennett C. L.; Spiegel D. M.; Macdougall I. C.; et al. A review of safety, efficacy, and utilization of erythropoietin, darbepoetin, and peginesatide for patients with cancer or chronic kidney disease. Semin Thromb Hemost 2012, 38(8), 783–96.
• Bones J.; McLoughlin N.; Hilliard M.; Wynne K.; Karger B. L.; Rudd P. M. 2D-LC analysis of BRP 3 erythropoietin N-glycosylation using anion exchange fractionation and hydrophilic interaction UPLC reveals long poly-N-acetyl lactosamine extensions. Anal Chem 2011, 83(11), 4154–62.
• Lauber M. A.; Yu Y. Q.; Brousmiche D. W.; et al. Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent that Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MS Detection. Anal Chem 2015, 87(10), 5401–8.