Enhancing the Peak Capacity of High Molecular Weight N-Glycan HILIC Separations with a Wide-Pore Amide Bonded Stationary Phase

Význam tématu

Proteinová glykosylace patří mezi klíčové posttranslační modifikace ovlivňující stabilitu, účinnost a imunogenicitu bioterapeutik. Analýza uvolněných a fluorescenčně značených N-glykanů pomocí HILIC chromatografie umožňuje detailní profilaci komplexních glykanových struktur. U bioterapeutik s vysokou molekulovou hmotností, nesoucích tri- a tetra-antennární glykany, je ovšem nutné dosáhnout vyššího rozlišení, než nabízí standardní stacionární fáze s úzkými póry.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo porovnat separační výkon konvenčního glykanového amide stacionárního fáze (130 Å) se širokopórovým glycoproteinovým BEH amide materiálem (300 Å) při analýze RapiFluor-MS značených tri- a tetra-antennárních N-glykanů z rekombinantního lidského faktoru IX.

Použitá instrumentace

• UPLC systém ACQUITY UPLC s fluorescenční detekcí a MS rozhraním
• Stacionární fáze Glycan BEH amide, 130 Å, 1,7 µm, 2,1×150 mm
• Stacionární fáze Glycoprotein BEH amide, 300 Å, 1,7 µm, 2,1×150 mm
• GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit

Metodika

N-glycany byly uvolněny z lidského IgG a rekombinantního faktoru IX postupem rychlé deglykosylace, označeny fluorescenčně a hmotnostně aktivním činidlem RapiFluor-MS a vyčištěny HILIC SPE µElution kolonkou. Separace probíhala na zmíněných amide kolonkách při režimu HILIC podle doporučení výrobce, přičemž se vyhodnocovaly retenční časy, šířky půlvýšky a šířky retenčního okna.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání chromatogramů ukázalo, že širokopórová kolona (300 Å) poskytuje až 17% nárůst kapacity píků u vysoce rozvětvených glykanů faktoru IX ve srovnání s 130 Å materiálem. Zlepšení rozlišení umožnilo detekci nízkoho zastoupení forem FA4G4S2, FA4G4S3 a FA4G4Lac1S3, které se na běžné stacionární fázi takto čistě oddělit nedaří.

Přínosy a praktické využití metody

Vysoká kapacita píků a zdokonalené rozlišení širokopórové kolony umožňuje:

• Spolehlivou charakterizaci složitých, vysoce rozvětvených N-glykanů
• Kvalitativní a kvantitativní analýzu bioterapeutik ve fázi vývoje i kontroly kvality
• Rutinní monitoring glykosylace u biopharma produktů, např. faktor IX, erytropoetin či darbepoetin

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj širokopórových materiálů a integrace s vysokorozlišovacími MS systémy. Potenciál nabízejí projekty zaměřené na online derivatizaci, automatizaci přípravy vzorků a rozšíření aplikací na intactní glykoproteiny či komplexní biologické matrixy.

Závěr

Širokopórová amide kolona Glycoprotein BEH amide, 300 Å, 1,7 µm významně zvyšuje kapacitu a rozlišení HILIC separací vysoce rozvětvených N-glykanů. Studie prokázala až 17% nárůst kapacity píků a umožnila spolehlivější detekci minoritních forem, což přispívá k přesnější charakterizaci glykanových profilů v biopharmaceutické výrobě.

Reference

1. Lauber MA; Brousmiche DW; Hua Z; Koza SM; Guthrie E; Magnelli P; Taron CH; Fountain KJ. Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Novel Fluorescence and MS-Active Labeling Reagent. Waters Application Note 720005275EN 2015.
2. Ahn J; Yu YQ; Gilar M. UPLC-FLR Method Development of 2-AB Labeled Glycan Separation in Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC). Waters Application Note 720003238EN 2010.
3. Gustavsson PE; Larsson PO. Support Materials for Affinity Chromatography. In Handbook of Affinity Chromatography; Hage D, ed.; Taylor & Francis, 2006; pp 15–33.
4. Renkin EM. Journal of General Physiology 1954, 38, 225.
5. Yu YQ. Analysis of N-Linked Glycans from Coagulation Factor IX, Recombinant and Plasma Derived, Using HILIC UPLC/FLR/QTof MS. Waters Application Note 720004019EN 2011.
6. GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit Care and Use Manual 715004793EN.
7. Campbell MP; Royle L; Radcliffe CM; Dwek RA; Rudd PM. GlycoBase and autoGU: tools for HPLC-based glycan analysis. Bioinformatics 2008, 24(9), 1214–1216.
8. Lauber MA; Koza SM. Developing High Resolution HILIC Separations of Intact Glycosylated Proteins using a Wide-Pore Amide-Bonded Stationary Phase. Waters Application Note 720005380EN 2015.