A Universal, Optimized SPE Protocol for Clean-up of Tryptic Peptides in Protein Bioanalysis

Význam tématu

V proteomické bioanalýze je čištění tryp­tic­kých peptidů zásadní pro dosažení citlivé, reprodukovatelné a robustní LC-MS kvantifikace biologických léčiv. Efektivní odstranění zbytků trávicího pufru, digestačních reagentů, fosfolipidů a dalších matriceových složek snižuje matrix effecty a zlepšuje detekční limity i spolehlivost výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované práce bylo vyvinout univerzální, optimalizovaný SPE protokol pro čištění tryp­tic­kých peptidů vzniklých z trávení plazmatických či sérových vzorků, a to jak při přímém trávení, tak po imunoprůmětu. Výsledkem je ProteinWorks™ µElution SPE Clean-up Kit, který umožňuje koncentrovat peptidní digesty v 96-well formátu bez nutnosti sušení a rekonstituce.

Použitá metodika a instrumentace

• Sorbent Oasis® MCX (mixed-mode ion-exchange) ve formátu µElution 96-well destičky
• ProteinWorks™ eXpress Digest Kit pro rychlé tryptické trávení
• LC-MS/MRM analýza na reverzní chromatografii s iontovým výměnným sorbentem
• Automatizace pomocí vakuového či tlakového přetlaku pro zpracování celé destičky pod 20 minut

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizovaná metodika dosahuje průměrné obnovy signature peptidů z monoklonálních protilátek ~104 %, u murinního interního standardu ~84 %.
• Díky µElution formátu stačí eluce v objemu 25 µl, což eliminuje potřebu sušení a snižuje ztráty peptidů adsorpcí.
• Byly stanoveny hranice maximálního proteinového zatížení: do 1,25 mg celkové bílkoviny na jamku a doporučený rozsah objemu pro naložení digesta 15–25 µl.
• Pro různé výchozí objemy plazmy/séra (15–70 µl) a po imunoprůmětu byly navrženy specifické pokyny, které maximalizují citlivost při minimálním objemu eluátu.
• Zkrácené doby zpracování a možnost plné automatizace zvyšují throughput a konzistenci výsledků.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoduchá implementace i pro méně zkušené uživatele díky přednastaveným pokynům a konzistentnímu vybavení.
• Zvýšená citlivost LC-MS analýzy minimalizuje potřebu velkých objemů vzorku.
• Zlepšená robustnost metodiky díky efektivnímu odstraňování matriceových interferencí.
• Úspora času a nákladů díky eliminaci kroků sušení a rekonstituce.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na kvantifikaci dalších biologik a peptidů s výrazně odlišnými fyzikálně-chemickými vlastnostmi.
• Integrace s pokročilými automatizačními platformami a online SPE-LC-MS systémy pro high-throughput klinické studia.
• Vývoj nových sorbentních materiálů cílených na selektivnější retenci specifických peptidových modifikací.

Závěr

Optimalizovaný SPE protokol s využitím µElution Oasis MCX destičky nabízí univerzální, rychlé a vysoce reprodukovatelné čištění tryp­tic­kých peptidů bez nutnosti sušení. Metoda významně zvyšuje obnovu a citlivost LC-MS analýz proteinových terapeutik, je snadno automatizovatelná a vhodná pro široké spektrum bioanalytických laboratorních aplikací.

Reference

• Medicines in Development: Biologics, PhRMA, report 2013.