Developing a Chiral Amino Acid Analysis Method That Uses Column Switching

Význam tématu

Chirální aminokyseliny existují ve dvou enantiomerních formách D a L, přičemž L-formy jsou hlavní součástí proteinů a živin v organismech. D-formy, i když v těle méně zastoupené, mají významné role jako biomarkery, součásti fermentovaných potravin či modulátory fyziologických procesů v centrálním nervovém systému.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout rychlou, vysoce selektivní a citlivou metodu pro rozlišení a kvantifikaci D- a L-aminokyselin bez nutnosti derivatizace. Studie představuje systém využívající dvě chirální kolony a vysokotlaké přepínání kolony pro automatické střídání analýzy a stabilizace kolony.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický systém sestával z:

• kapalinového chromatografu s dvojicí pump (Pump A pro kolonu CR-I (+), Pump B pro kolonu CR-I (–))
• dvou vysokotlakých přepínacích ventilů pro automatické přepínání kolon
• chirálních kolon CROWNPAK CR-I (+) a CR-I (–), 3 mm × 150 mm, 5 µm (DAICEL)
• mobilní fáze: acetonitril/ethanol/voda/TFA = 80/15/5/0,5
• průtok 0,6 mL/min, objem injekce 1 µL, teplota kolony 20 °C
• hmotnostní detekce: ESI+ (4,0 kV), rozstřik 3 L/min, sušicí plyn 15 L/min, ohřev sušícího plynu 250 °C, block heater 300 °C

Hlavní výsledky a diskuse

Systém umožnil separaci většiny D- a L-aminokyselin s vysokou citlivostí. Analýza standardní směsi (1 ng/µL) ukázala obdobné poměry oblastí pro většinu analyzovaných párů. Některé páry (Gln/Lys, Ile/allo-Ile, Thr/allo-Thr) vykazovaly stejnou MRM tranzici a vyžadovaly střídání kolony: kolona CR-I (+) rozlišila např. D-Thr vs. D-allo-Thr, zatímco CR-I (–) rozlišila L-Thr vs. L-allo-Thr.

Přínosy a praktické využití metody

• bezderivatizační postup zkracuje dobu analýzy
• vysoká citlivost a selektivita díky hmotnostní detekci
• plně automatické přepínání kolony zajišťuje kontinuitu analýzy
• aplikace v biochemii, potravinářství, farmaceutickém výzkumu, QA/QC

Budoucí trendy a možnosti využití

• integrace do on-line monitorovacích systémů fermentace či bioprocesů
• rozšíření metodiky na další chirální metabolity a peptidy
• miniaturizace a automatizace pro vysokokapacitní skrining
• použití strojového učení k optimalizaci chromatografických podmínek

Závěr

Představená metoda umožňuje rychlou, citlivou a plně automatickou analýzu D-/L-aminokyselin bez derivatizace. Využití dvou chirálních kolon s přepínáním zaručuje široký rozsah aplikací při vysoké spolehlivosti.

Reference

• Nakano Y., Konya Y., Taniguchi M., Fukusaki E. Journal of Bioscience and Bioengineering, 123, 134–138 (2016)