High-throughput comprehensive analysis of trace D- and L- amino acids using extra-facile chiral separation and column switching

Význam tématu

Chirální aminokyseliny hrají klíčovou roli v biologických i potravinářských procesech. L-formy jsou stavebními jednotkami proteinů, zatímco stopové D-formy jsou stále více zkoumány jako biomarkery, při studiu metabolismu či kvalitativní kontrole fermentovaných potravin. Rychlá a spolehlivá analýza poměrá L/D aminokyselin usnadňuje výzkum ve farmaceutickém, biotechnologickém a potravinářském průmyslu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout vysoce propustný (high-throughput) postup pro kompletní screening stopových D- a L-aminokyselin bez nutnosti derivatizace, s analýzou do 10 minut. Metoda kombinuje extra‐efektivní chirální separaci s automatickým přepínáním dvou kolonek pro simultánní stanovení 22 aminokyselin v komplexních vzorcích, jako jsou černé octy a jogurty.

Použitá metodika a instrumentace

Využitá chromatografická metoda:

• Chirální kolony CROWNPAK CR-I(+) a CR-I(–) (3 mm × 150 mm, 5 µm) při 20 °C
• Mobilní fáze: acetonitril/ethanol/voda/kyselina trifluoroctová (80/15/5/0,5), tok 0,6 mL/min
• Přepínání kolon (FCV ventily) řízené časovým programem LC (LC Time Program)
• Příprava vzorku: dvoustupňová tekutá extrakce (metanol, voda, chloroform) následovaná ředěním mobilní fází

Detekce a kvantifikace:

• HPLC systém Prominence/Nexera X2 (Shimadzu)
• Triple kvadrupólový hmotnostní spektrometr LCMS-8050/8060 se zdrojem ESI v pozitivním módu
• Přímé MRM přechody pro 22 D/L aminokyselin
• Automatizované dávkování vzorků (SIL-30AC) s programem pretretmentu umožňujícím dvě injekce z jednoho vzorku

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza černých octů a jogurtů prokázala přítomnost D-aminokyselin ve všech vzorcích. Klíčové nálezy:

• D-Alaninu bylo detekováno ve všech vzorcích; koncentrace D-Alanin/L-Alanin se lišila mezi 3,8 % až 164 % v octech
• V jogurtech se objevilo vysoké množství D-Glu (>40× oproti L-Glu), zatímco L-Glu chybělo
• Jogurt D vykazoval zvýšené hladiny D-Alaninu a D-Lysinu

Chromatogramy ukázaly, že i blízce příbuzné izoformy (např. D-Thr a D-allo-Thr) lze oddělit díky využití dvou chirálních kolon v jediném běhu.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený systém umožňuje:

• Rychlé stanovení kompletního profilu D/L aminokyselin do 10 min bez derivatizace
• Vysokou citlivost a reprodukovatelnost díky MRM detekci
• Automatizaci a kontinuální zpracování sérií vzorků, ideální pro QA/QC a výzkumné laboratoře

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Další softwarová automatizace datového zpracování a integrace s metabolomickými platformami
• Miniaturizace přístrojů a nasazení v klinické diagnostice pro screening D-aminokyselin jako biomarkerů
• Rozšíření na analýzu peptidů a dalších chirálních metabolitů v komplexních matricích

Závěr

Implementace chirálních kolon s automatickým přepínáním a optimalizovaným programem pretretmentu přináší efektivní a vysoce propustný workflow pro kompletní analýzu stopových D/L aminokyselin. Metoda nabízí robustní, citlivé a rychlé stanovení, vhodné pro potravinářský výzkum, biotechnologii a klinické aplikace.

Reference

1. Nakano Y., Konya Y., Taniguchi M., Fukusaki E. Journal of Bioscience and Bioengineering, 123, 134–138 (2017)