Developing a Chiral Amino Acid Analysis Method That Uses Column Switching

Význam tématu

Analýza D- a L-aminokyselin je zásadní pro pochopení jejich biologických rolí, především v oblasti potravinářství, farmacie a biomarkerů. Přesná detekce chirálních forem aminokyselin umožňuje sledovat kvalitu fermentovaných potravin, studovat fyziologické procesy centrálního nervového systému a identifikovat potenciální zdravotní a kosmetické aplikace.

Cíle a přehled studie

Cílem publikované aplikace bylo vyvinout rychlou a plně automatizovanou metodu pro separaci a kvantifikaci D- a L-aminokyselin bez nutnosti derivatizace. Klíčovým prvkem je použití vysokotlakého přepínání mezi dvěma typy chirálních kolón, čímž se zkracuje doba analýzy a zvyšuje citlivost i selektivita měření.

Použitá metodika a instrumentace

Pro realizaci metody byla využita kombinace kapalné chromatografie a hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS) s následující konfigurací:

• Chirické kolony: CROWNPAK CR-I (+) a CR-I (–) (3×150 mm, 5 μm)
• Vysokotlaké přepínací ventily (FCV) pro automatické přepínání mezi kolónami
• Mobilní fáze: acetonitril/ethanol/voda/TFA (80/15/5/0,5)
• Průtok: 0,6 mL/min, objem injekce 1 μL, teplota kolony 20 °C
• MS detekce: ESI+ (sondové napětí +4,0 kV), sušící plyn 15 L/min, rozptylový plyn 3 L/min, teplota rozhraní 250 °C

Hlavní výsledky a diskuse

Automatické přepínání mezi kolónami umožnilo paralelní stabilizaci jedné kolony při běhu analýzy na druhé. Referenční standard se 13C6-L-Phe vnitřním standardem prokázal vyrovnané poměry plochy většiny aminokyselin mezi oběma kolónami. Některé párů enantiomerů (Gln/Lys, Ile/allo-Ile, Thr/allo-Thr) nelze rozlišit na jedné kolóně, jejich separace je však možná výměnou kolony, čímž se dosáhne kompletního profilu D/L aminokyselin.

Přínosy a praktické využití metody

Nová metoda nabízí:

• Rychlou analýzu bez derivatizace
• Vysokou selektivitu i citlivost díky MS detekci
• Plnou automatizaci a minimalizaci prostojů mezi analýzami
• Univerzální přístup ke kompletnímu chirálnímu profilu aminokyselin

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují integraci vyšších průtokových rychlostí, vývoj nových chirálních fází s lepší retencí vybraných párů enantiomerů a aplikaci této platformy v klinické diagnostice a vývoji nových farmaceutických látek. Dále je perspektivní spojení se systémy pro vysokovýkonnou automatizaci a pokročilou datovou analýzu pro metabolomické studie.

Závěr

Představená LC-MS/MS metoda s vysokotlakým přepínáním chirálních kolon úspěšně rozlišuje a kvantifikuje 20 proteinogenních D- a L-aminokyselin během jediné běžné analýzy. Kombinace rychlosti, citlivosti a plné automatizace ji činí vhodnou pro různé aplikace od potravinářského průmyslu po klinický výzkum.

Reference

1. Nakano Y., Konya Y., Taniguchi M., Fukusaki E. Journal of Bioscience and Bioengineering, 123, 134–138 (2016).