Direct Analysis of Opioids and Metabolites in Oral Fluid by Mixed-mode μElution SPE Combined with UPLC-MS/MS for Forensic Toxicology

Význam tématu

Analýza opioidů a jejich metabolitů v orální tekutině je klíčová pro forenzní toxikologii a detekci nedávné intoxikace či ovlivnění jedince.
Oproti moči a krvi poskytuje orální tekutina rychlejší indikaci aktivity drogy, přičemž je odběr méně invazivní, s nižším rizikem kontaminace a adulterace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a validovat rychlou, citlivou a přímou metodu pro kvantifikaci 26 opiátů, syntetických opioidů a jejich metabolitů v orální tekutině, aniž by bylo nutné provádět enzymatickou či chemickou hydrolýzu glukuronidových konjugátů.
Metoda kombinuje extrakci pomocí mixed-mode μElution SPE a následnou analýzu UPLC-MS/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky orální tekutiny byly odebrány sběrným aplikátorem s následnou stabilizací v pufru.
Příprava vzorku:

• Přidání kyseliny fosforečné a deuterovaných vnitřních standardů.
• Extrahováno v Oasis MCX μElution 96-well destičce: kondicionování MeOH a vodou, aplikace vzorku, dvoufázové promývání (2% kyseliny, MeOH, IPA).
• Eluce 60:40 ACN:IPA s 5% NH4OH, vysušení pod dusíkem, rekonstituce ve vodě/ACN s kyselinou formiovou.
• Injekce 10 µL na UPLC-MS/MS.

Instrumentace:

• Oasis MCX μElution Plate, 96-well
• ACQUITY UPLC I-Class
• ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 µm, 2.1×100 mm)
• XEVO TQD hmotnostní spektrometr (ESI+, MRM)

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografie dosáhla kompletní baseline separace všech kritických párů izomerů za méně než 5,5 minuty.
Průměrný procentuální výtěžek extrakce byl 78,8 % při eluci ACN:IPA, liniární rozsah kalibrace od 5 do 500 ng/mL (1,25–125 ng/mL pro fentanyl) s R² ≥ 0,989.
QC vzorky (7,5, 25, 150, 300 ng/mL) vykázaly přesnost v rámci ±15 % a relativní standardní odchylku <15 % u většiny bodů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje přímou detekci glukuronidových metabolitů bez rizika falešných negativ vznikajících neúplnou hydrolýzou.
Nízký objem vzorku (100 µL orální tekutiny) šetří biologický materiál pro další testy nebo opakované analýzy.
Celkový čas přípravy a analyzování jednoho vzorku je výrazně zkrácen, což zvyšuje průtok laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

Migrace na vysoce přesnou hmotnostní spektrometrii (HRMS) pro širší screening syntetických opioidů.
Automatizace přípravy vzorků a online SPE-UPLC propojení zvýší efektivitu a reproducibilitu.
Rozšíření panelu analyzovaných látek o nové drogy a jejich metabolity, včetně designer opioidů.
Možnosti miniaturizace metodiky pro bod-of-care testování a adaptace na další biologické matricie.

Závěr

Prezentovaná metodika pro přímou analýzu opioidů a metabolitů v orální tekutině pomocí mixed-mode μElution SPE a UPLC-MS/MS je validovaná, rychlá, citlivá a robustní.
Umožňuje spolehlivou detekci v širokém koncentračním rozsahu bez potřeby hydrolýzy.

Reference

• Goldberger B. A., Cone E. J. Confirmatory tests for drugs in the workplace by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1994; 674(1-2):73–86.
• Gustavsson E. et al. Validation of direct injection electrospray LC-MS/MS for confirmation of opiates in urine drug testing. Journal of Mass Spectrometry, 2007; 42(7):881–889.
• Murphy C. M., Huestis M. A. LC-ESI-MS/MS analysis for quantification of morphine, codeine and glucuronides in human urine. Journal of Mass Spectrometry, 2005; 40(11):1412–1416.
• Edinboro L. E., Backer R. C., Poklis A. Direct Analysis of Opiates in Urine by LC-Tandem MS. Journal of Analytical Toxicology, 2005; 29(7):704–710.
• French D., Wu A., Lynch K. Hydrophilic interaction LC-MS/MS analysis of opioids in urine: significance of glucuronide metabolites. Bioanalysis, 2011; 3(23):2603–2612.
• Wang P. et al. Incomplete Recovery of Prescription Opioids in Urine using Enzymatic Hydrolysis of Glucuronide Metabolites. Journal of Analytical Toxicology, 2006; 30(8):570–575.