Direct Analysis of Opioids and Metabolites from Whole Blood Using Ostro Sample Preparation Plates Combined with UPLC-MS/MS for Forensic Toxicology

Význam tématu

Odborná analýza opioidů a jejich glukuronidových metabolitů v plné krvi je zásadní při forenzní toxikologii pro objasnění příčin úmrtí, dopravních nehod či zneužití analgetik. Přímá detekce glukuronidů bez enzymatické hydrolýzy šetří čas i náklady a minimalizuje riziko neúplné konverze.

Cíle a přehled studie

Studie prezentuje rychlou, jednoduchou metodu pro stanovení 22 opioidů a jejich metabolitů přímo z plné krve. Využívá Ostro sample preparation pláty a UPLC-MS/MS systém k eliminaci enzymatické hydrolýzy a zkrácení doby analýzy.

Použitá instrumentace

• Ostro Pass-through 96-well Sample Preparation Plates
• ACQUITY UPLC BEH C18 kolona (2.1×100 mm, 1.7 µm)
• ACQUITY UPLC systém
• Xevo TQD hmotnostní spektrometr
• Waters MassLynx Software v4.1

Použitá metodika

• Předúprava plné krve: lyze buněk 0.1 M ZnSO4/0.1 M NH4CH3COOH, precipitace proteinů acetonitrilem s vnitřními standardy
• Průtok pláty Ostro: pasáž eluátů do 96 well destičky, odpaření N2, rekonstituce v roztoku s 0.1% kyselinou mravenčí a 2% ACN
• Chromatografie: gradient 0.1% kyselina mravenčí ve vodě (A) a v ACN (B), lineárně 2→52.8% B za 6 min, průtok 0.4 mL/min, injekce 10 µL, doba analýzy menší než 5.5 min, celkový cyklus 8 min
• MS/MS: ESI pozitivní režim, MRM, optimalizované napětí kapiláry 1 kV, kolizní energie a filtr napětí dle sloučeniny

Hlavní výsledky a diskuse

• Validní separace 22 látek včetně isobarických párů během 5.5 min
• Obnovení sloučenin z plné krve většinou nad 80% s minimem 60% (výjimkou tři ranně eluované glukuronidy)
• Lineárnost kalibrace R2 > 0.973, průměrná odchylka od křivky < 2% a průměrné CV < 10% u většiny sloučenin
• Sensitivita vyhovující detekci 5 ng/mL (1.25 ng/mL pro fentanyl) s poměrem signál/šum nad 20

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace enzymatické hydrolýzy glukuronidů zrychluje a zjednodušuje analýzu
• Ostro destičky umožňují rychlou předúpravu bez odstřeďování nebo přenosu vzorků
• Metoda poskytuje vysokou propustnost při spolehlivé detekci a kvantifikaci
• Vhodné pro forenzní laboratoře, klinické studie a QA/QC aplikace

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu o nové opioidní metabolity a syntetické drogy
• Automatizace přípravy vzorků a integrace s robotickými systémy
• Využití vysoce výkonné spektrometrie s vysokým rozlišením pro širší detekci
• Miniaturizace metod pro nízkoodběrové a bodové testování

Závěr

Popsaný postup kombinuje Ostro sample preparation pláty a UPLC-MS/MS pro rychlou, citlivou a reprodukovatelnou analýzu opioidů a glukuronidových metabolitů v plné krvi. Metoda výrazně zvyšuje efektivitu, odstraňuje potřebu hydrolýzy a splňuje požadavky soudní toxikologie.

Reference

1. Goldberger BA, Cone EJ. Confirmatory tests for drugs in the workplace by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1994; 674(1-2): 73-86.
2. Wang P et al. Incomplete recovery of prescription opioids in urine using enzymatic hydrolysis of glucuronide metabolites. Journal of Analytical Toxicology. 2006; 30(8): 570-575.
3. Gustavsson E et al. Validation of direct injection electrospray LC-MS/MS for confirmation of opiates in urine drug testing. Journal of Mass Spectrometry. 2007; 42(7): 881-889.
4. Murphy CM, Huestis MA. LC-ESI-MS/MS analysis for the quantification of morphine, codeine, morphine-3-β-D-glucuronide, morphine-6-β-D-glucuronide, and codeine-6-β-D-glucuronide in human urine. Journal of Mass Spectrometry. 2005; 40(11): 1412-1416.
5. Edinboro L, Backer RC, Poklis A. Direct analysis of opiates in urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology. 2005; 29(7): 704-710.
6. French D, Wu A, Lynch K. Hydrophilic interaction LC-MS/MS analysis of opioids in urine: significance of glucuronide metabolites. Bioanalysis. 2011; 3(23): 2603-2612.