A Comprehensive Method for the Analysis of Pain Management Drugs and Drugs of Abuse Incorporating Simplified, Rapid Mixed-Mode SPE with UPLC-MS/MS for Forensic Toxicology

Význam tématu

Forenzní toxikologie vyžaduje rychlé, citlivé a spolehlivé stanovení širokého spektra léčiv proti bolesti a látek zneužívaných k drogám. Tradičně se pro každou skupinu látek používají samostatné metody, což zvyšuje nároky na čas, pracovní síly a spotřební materiál. Cílem je sjednotit extrakci a analýzu v jediném vysoce výkonném postupu, který zkrátí dobu přípravy i doby běhu analýzy, a přitom zajistí přesné a reprodukovatelné výsledky.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje komplexní analytickou metodu pro kvantifikaci až 80 analytů v moči. Klíčové body:

• Jednoduchá hydrolýza a extrakce ve 100µl vzorku bez přenosu mezi nádobami.
• Smíšené SPE na Oasis MCX µElution destičkách, eliminace kondice a ekvilibrace sorbentu.
• Rychlá chromatografie na ACQUITY UPLC BEH C18 koloně s celkovým časem 4 minuty.
• Detekce a kvantifikace pomocí Xevo TQ-S micro se zdokonaleným dynamickým rozsahem.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class (FTN) s BEH C18, 1.7 μm, 2.1×100 mm, 40 °C
• Oasis MCX µElution destičky pro smíšené SPE
• Xevo TQ-S micro hmotnostní spektrometr s ESI+ a Xtended Dynamic Range
• MassLynx a TargetLynx XS pro sběr a kvantifikaci dat

Použitá metodika

Vzorky (100 µl moče) se ve studených destičkách smísily s pufrem a β-glukuronidázou pro hydrolýzu konjugátů. Po acidifikaci (4% H₃PO₄) se vzorky natáhly do sorbentu vakuově, omyly se 80:20 H₂O:MeOH, vysušily a eluovaly 50:50 ACN:MeOH s 5% NH₄OH. Následovalo ředění do konečného objemu před UPLC-MS/MS analýzou. Gradientní eluce 0–4 min proběhla mezi 0.1% FA ve vodě a 0.1% FA v acetonitrilu při 0.6 ml/min.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografie dosáhla základního rozlišení pro kritické páry látek do 4 minut. Průměrné procento zpětného získání (recovery) přesáhlo 70 % pro 76 z 78 kvantitativně stanovených analytů, s CV <10 %. Surové matrice způsobily až 60% potlačení signálu, ale po korekci pomocí stabilně značených IS byla většina matricových efektů <20 % odchylky. Kalibrační křivky (7 bodů) splnily FDA požadavky (R²≥0,99, bias <15/20 %), LOQ pokrývaly rozsah 2–2500 ng/ml. Přesnost a reprodukovatelnost byly v rámci 15 % (nejnižší bod 20 %). Externí QC materiál vykázal 93 % výsledků v rámci ±20 % cílových hodnot.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje forenzním laboratořím:

• Rychlou přípravu vzorků bez přenosových kroků.
• Vysokou propustnost (>200 vzorků/den).
• Široký dynamický rozsah simultánní kvantifikace.
• Spolehlivou identifikaci a kvantifikaci v odlišných matricích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit na další biologické matice (krev, sérum), přidat nové metabolity či nelegální látky a plně automatizovat přípravu. Další generace UPLC-MS/MS by mohla zkrátit doby analýzy pod 3 minuty a zvýšit citlivost s vyšší propustností.

Závěr

Popsaná kombinace smíšeného µElution SPE, vysokorychlostní UPLC a vysoce výkonného MS/MS poskytuje robustní, rychlou a přesnou platformu pro komplexní analýzu léčiv proti bolesti a drog zneužívaných v soudní toxikologii.

Reference

1. Zhang X., Danaceau J.P., Chambers E.: Quantitative analysis of THC and its metabolites in whole blood using LC-MS/MS for Toxicology and Forensic Laboratories. Waters Application Note (720005769EN), 2016.
2. Danaceau J.P., Chambers E.: LC-MS/MS analysis of urinary benzodiazepines and Z-drugs via a simplified, mixed-mode sample preparation strategy. Waters Application Note (720005973EN), 2017.
3. Bansal S., DeStefano A.: Key elements of bioanalytical method validation for small molecules. The AAPS Journal 9(1), E109–E114, 2007.