Future-proofing the Biopharmaceutical QC Laboratory: Using the ACQUITY UPLC H-Class Bio System to Run SEC-HPLC and SEC-UPLC

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) je klíčová metoda pro kontrolu kvality biotechnologických léčiv, která umožňuje stanovit stupeň agregace proteinových molekul, jež ovlivňuje jejich bezpečnost a účinnost. Přechod z tradiční HPLC na UPLC přináší zvýšenou chromatografickou účinnost, lepší rozlišení a vyšší citlivost bez náročné přípravy vzorků.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl:

• přenos existující SEC-HPLC metody pro detekci agregátů monoklonálních protilátek z legacy HPLC na ACQUITY UPLC H-Class Bio System,
• optimalizaci podmínek pro SEC-UPLC za účelem zkrácení doby analýzy a zlepšení rozlišení,
• srovnání chromatografických parametrů, citlivosti a přesnosti mezi HPLC a UPLC.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class Bio System s Bio Quaternary Solvent Manager a Bio Sample Manager,
• UV detektor (214 nm) s titaniovou průtokovou cely,
• Biosuite SEC Column (10 µm, 7,5 × 300 mm) pro HPLC,
• ACQUITY UPLC Protein BEH SEC Column (1,7 µm, 4,6 × 150 mm) pro UPLC,
• Empower 3 software pro akvizici a zpracování dat.

Metodika

• HPLC: isokratický běh s 20 mM fosfátovým pufrem a 200 mM NaCl (pH 6,8), průtok 0,4 mL/min, doba 35 min, objem injekce 20 µL, kolona Biosuite SEC 250 Å 10 µm × 300 mm;
• UPLC: stejný mobilný fázi, optimalizovaný průtok 0,885 mL/min, doba 3 min, injekce 4 µL, kolona BEH SEC 200 Å 1,7 µm × 150 mm;
• vzorky: standardní SEC200 protein mix a terapeutická monoklonální protilátka infliximab;
• vyhodnocení retenčních časů, relativních plošných poměrů a rozlišení píků.

Hlavní výsledky a diskuse

• Přenos SEC-HPLC metody na ACQUITY UPLC H-Class Bio bez změn parametrů vedl k minimálním posunům retenčních časů (< 0,3 min) a plošných poměrů (< 1 %).
• UPLC přineslo významné zlepšení rozlišení mezi všemi páry píků (např. nárůst Rs z cca 3,6 na 9,4 u SEC200 standardu).
• Analýza infliximabu potvrdila konzistentní kvantifikaci monomeru a dimeru, přičemž UPLC odhalilo detailnější rozdělení agregovaných forem.
• Doba analýzy se zkrátila z 35 min na 3 min bez ztráty přesnosti či citlivosti.

Přínosy a praktické využití metody

• možnost sjednotit QC a vývojové laboratoře na jediné UPLC platformě,
• zvýšení průtokovosti a propustnosti laboratoře,
• citlivější odhalování nízko zastoupených agregátů,
• úspora rozpouštědel a provozních nákladů díky kratším běhům.

Budoucí trendy a možnosti využití

• integrace SEC-UPLC s hmotnostní spektrometrií pro komplexní charakterizaci proteinů,
• automatizace a online monitorování QC procesů v bioprodukčním provozu,
• další miniaturizace kolonek a zmenšování částic pro ultra rychlé analýzy,
• rozšíření aplikací na nové biologické entity jako jsou konjugáty, virové vektory či nanostruktury.

Závěr

Studie ukazuje, že SEC-HPLC metody lze bez obtíží převést na SEC-UPLC na ACQUITY UPLC H-Class Bio System. Přitom se zachovává přesnost kvantifikace agregátů a současně dochází ke značnému zlepšení rozlišení a významnému zkrácení doby analýzy, což podporuje budoucí směřování QC laboratoří k technologiím UPLC.

Reference

• Cosgrave E.F.J., McCarthy S.M. Future-proofing the Biopharmaceutical QC Laboratory: Using the ACQUITY UPLC H-Class Bio System to Run SEC-HPLC and SEC-UPLC. Waters Corporation, May 2014.