Absolute Quantification of Yeast Kinases by LC/MS/MS using QconCAT and MRM Technologies

Význam tématu

Absolutní kvantifikace proteinů je klíčová pro systémovou biologii a modelování buněčných procesů. Stanovení přesného počtu enzymů a kináz v kvasinkách umožňuje lepší porozumění signalizaci a metabolismu na úrovni buňky.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a aplikovat metodu založenou na QconCAT pro absolutní kvantifikaci 138 kvasinkových kináz. Využívá se časově plánovaná MRM (multiple reaction monitoring) v nanoUPLC systému spojeném s tandemovým kvadrupólem (Xevo TQ a Xevo TQ-S) k pokrytí dynamického rozsahu pěti řádů.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Design syntetických QconCAT proteinů nesoucích kvantotypické izotopově značené peptidy.
• Společná tryptická digesce QconCAT a kvasinkových vzorků.
• Nanoskopická separace na nanoACQUITY UPLC s trapem Symmetry C18 a analytickou kolónou BEH T3 C18.
• Časově plánovaný MRM s kvadrupólovým rozlišením 0,7 Da (Xevo TQ) a 0,4 Da (Xevo TQ-S).

Instrumentace:

• nanoACQUITY UPLC System
• Symmetry C18 trap kolóna
• ACQUITY UPLC BEH T3 C18 analytická kolóna
• Xevo TQ MS a Xevo TQ-S MS
• MassLynx Software s TargetLynx Application Manager
• Skyline a mProphet pro zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

• Peptidy byly rozděleny do kategorií A (obě formy detekovány), B (pouze QconCAT) a C (neúspěšná detekce).
• Na Xevo TQ-S s vyšším rozlišením a citlivostí se počet peptidů typu A zvýšil o 44 % a detekovaných proteinů o 26 % ve srovnání s Xevo TQ.
• Vysoká korelace kvantifikací mezi oběma platformami (Pearson > 0,9) a dobrý soulad s počty kopií na buňku z databáze PaxDb.
• Metoda odhalila a kvantifikovala 20 kvasinkových kináz, které dosud nebyly publikovány.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje robustní relativní i absolutní kvantifikaci proteinů přes široký dynamický rozsah, poskytuje data pro matematické modelování buněčných procesů a nachází uplatnění ve výzkumu, farmaceutickém průmyslu i QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na další organismy a podskupiny proteomu.
• Zlepšení predikce kvantotypických peptidů využitím strojového učení.
• Integrace více úrovní omických dat a rozvoj softwarových nástrojů pro vysokopropustné kvantifikace.

Závěr

Kombinace QconCAT a MRM na vysoce citlivé kvadrupólové hmotnostní spektrometrii přináší spolehlivou a rozšiřitelnou platformu pro absolutní kvantifikaci kvasinkových kináz. Moderní instrumentace se zvýšeným rozlišením značně rozšiřuje počet kvantifikovatelných proteinů a podporuje další výzkum systémové biologie.

Reference

1. Brownridge P. et al. Proteomics. 2011;11(15):2957-70.
2. Beynon RJ et al. Nat Methods. 2005;2(8):587-9.
3. Giles K, Gordon D. ASMS 2010 poster.
4. MacLean B et al. Bioinformatics. 2010;26(7):966-8.
5. Reiter L et al. Nat Methods. 2011;8(5):430-5.