Tof MRM for the Quantification of Peptide Biomarkers in Human Glioblastoma with the Xevo™ MRT Mass Spectrometer

Význam tématu

Glioblastom je vysoce agresivní nádor centrálního nervového systému s nízkou pětiletou přežívaností pod 10 %.
Kvantifikace fosforylovaných peptidů umožňuje detailní profilování signálních drah protein kináz a podporuje vývoj cílených léčebných postupů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat použití módu akvizice Tof MRM na hmotnostním spektrometru Xevo MRT pro absolutní kvantifikaci fosfopeptidů spojených s glioblastomem.
Studie porovnává dynamický rozsah, citlivost a lineární odezvu Tof MRM s konvenčním MRM na Xevo TQ Absolute.
Experiment zahrnuje stanovení regulačních peptidových markerů ve čtyřech lidských glioblastomových buněčných liniích (ošetřených a neošetřených ADI-PEG20) pomocí těžce značených standardů.

Použitá metodika

Buněčné lysáty byly připraveny s proteázovými a fosfatázovými inhibitory, redukovány DTT a alkylačním činidlem, poté tráveny trypsinem.
Fosfopeptidy se obohacovaly pomocí komerčního kitu MassPREP Phosphopeptide Enrichment Kit.
Standardy byly připraveny ze směsi HeLa digestu se syntetickými těžce značenými peptidy (13C15N na C-terminu Lys/Arg).
Chromatografické separace probíhaly na systému Evosep One s Evotip Pure a 30 SPD metodou (48min cyklus).
Eluát vstupoval do NanoLockSpray ionizační trysky s 20µm emitorem.
Akvizice dat probíhala v módu Tof MRM na Xevo MRT s rozlišením ~1 Da, dobou dwell time 70 ms a optimalizovaným kolizním napětím.
Kvantitativní křivky se generovaly s vážením 1/x a automatickou integrací v rámci platformy waters_connect.

Použitá instrumentace

• Xevo MRT Mass Spectrometer (Tof MRM, Enhanced Duty Cycle)
• Xevo TQ Absolute Triple Quadrupole Mass Spectrometer (MRM)
• Evosep One (chromatografie 30 SPD)
• Evotip Pure (připravené SPE tipy)
• NanoLockSpray ion source s 20µm emitorem
• Waters MassPREP Phosphopeptide Enrichment Kit
• waters_connect Software Platform (MS Quan Application)

Hlavní výsledky a diskuse

Obě platformy prokázaly čtyři dekády lineárního rozsahu s koeficientem R2>0,99 a limity detekce LOQ 0,1 fmol a 1,0 fmol.
Srovnání signál-/-šum při 10 amol náběru ukázalo obdobné poměry ~6:1 pro oba systémy.
Ve skutečných vzorcích glioblastomových buněčných linií bylo možné statisticky odlišit hladiny fosfopeptidů (např. AEEDEpS z proteinu calnexinu, p=0,0276).
Díky vysokému rozlišení lze v komplexních matricích minimalizovat interference a zároveň zachovat retrospektivní možnost kvalifikace.

Přínosy a praktické využití metody

Integrace kvantitativních a kvalitativních dat v jednom experimentu zvyšuje efektivitu workflow v proteomice.
Enhanced Duty Cycle výrazně zlepšuje citlivost a využití iontů téměř na 100 %, což ocení výzkumné i rutinní laboratoře.
Platforma waters_connect zjednodušuje tok od sběru dat až po výsledky s automatizovanými kroky integrace a kalibrace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření Tof MRM na další posttranslační modifikace a cílené biomarkery.
Širší implementace klinických studií pro validaci terapeutických zásahů.
Využití big data analytiky a strojového učení pro automatizované odhalování vzorců v proteomických datech.
Multiplexní kvantifikace vyššího počtu analyzovaných látek v jediném běhu.

Závěr

Metoda Tof MRM na Xevo MRT spojuje vysoké rozlišení s vynikající kvantitativní přesností.
Výsledky potvrzují srovnatelnou citlivost a linearitu oproti tradičnímu TQ MRM a umožňují komplexní analýzu fosfoproteomu v glioblastomu.
Kompletní workflow v rámci waters_connect zajišťuje robustní a reprodukovatelnou platformu pro výzkum a průmyslové aplikace.

Reference

1. Poon M.T.C., Sudlow C.L.M., Figueroa J.D. et al. Longer-term (≥2 years) survival in patients with glioblastoma in population-based studies pre- and post-2005: a systematic review and meta-analysis. Sci Rep. 2020;10:11622. doi:10.1038/s41598-020-68011-4
2. Qin A., Musket A., Musich P.R., Schweitzer J.B., Xie Q. Receptor tyrosine kinases as druggable targets in glioblastoma: Do signaling pathways matter? Neuro-Oncology Advances. 2021;3(1):vdab133. doi:10.1093/noajnl/vdab133
3. Tomcyzk N., Wallace A., Richardson K., Grzyb A., Wildgoose J. Targeted High Resolution Quantification with Tof-MRM and HD-MRM. Application Brief. 720004728.
4. Hajji N., Garcia-Revilla J., Soto M.S., Perryman R., Symington J., Quarles C.C., Healey D.R., Guo Y., Orta-Vazquez M.L., Mateos-Cordero S. et al. Arginine deprivation alters microglial polarity and synergizes with radiation to eradicate non-arginine-auxotrophic glioblastoma tumors. J Clin Invest. 2022;132(6). doi:10.1172/JCI142137
5. Wang X. et al. The dual role of calnexin on malignant progression and tumor microenvironment in glioma. Sci Rep. 2024;14:30796.
6. Liu Y. et al. Calnexin promotes glioblastoma progression by inducing protective mitopagy through the MEK/ERK/BNIP3 pathway. Theranostics. 2025;15(6):2624–2648.