MRM Quantification of Chitotriosidase in Human Plasma

Význam tématu

Chitotriosidáza je klíčovým biomarkerem pro diagnostiku a sledování průběhu Gaucherovy choroby.
Přesné stanovení koncentrace a aktivity tohoto enzymu v lidské plazmě je zásadní pro hodnocení účinnosti enzymové terapie a pro výzkum nových léčebných postupů.
Tradiční fluorometrické metody mohou vykazovat zkreslení vlivem substrátové inhibice, což zvyšuje poptávku po vysoce citlivých a selektivních analytických přístupech, jako je LC/MS založené na MRM přístupu.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout a validovat cílenou LC/MRM-MS/MS metodu pro absolutní kvantifikaci chitotriosidázy v lidské plazmě a porovnat ji s bezznačkovým LC/MSE a konvenční fluorometrickou enzymovou assay.
Studie využila objevné bezznačkové experimenty LC/MSE k výběru proteotypických peptidů a následné konstrukci MRM přechodů pro přesnou detekci a měření enzymatické aktivity.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy kontrolních osob a pacientů před a po léčbě byly nejprve zbaveny nejhojnějších sérumových proteinů, poté denaturovány, redukovány, alkylovány a digesovány trypsinem.
Do vzorků byly přidány syntetické 13C značené varianty peptidů SFTLASSSDTR a YPLIQTLR jako interní standardy.

• LC/MSE: nanoACQUITY UPLC se C18 kolonkou, 1,5 hod. gradient 5–40 % acetonitrilu, SYNAPT MS, data-independent acquisition (5 eV a 15–35 eV).
• LC/MRM-MS/MS: nanoACQUITY UPLC, 30 min gradient 1–50 % acetonitrilu, Xevo TQ triple quadrupole, přechodová okna 1 Da, kolizní energie 15–20 eV, dwell time 25 ms.
• Informatika: ProteinLynx Global SERVER, IdentityE a VerifyE pro selekci a kvantifikaci proteotypických přechodů.

Hlavní výsledky a diskuse

Bezpečné odhady absolutní koncentrace chitotriosidázy pomocí LC/MSE korelovaly s fluorometrickými daty, přesto byly ve vybraných případech nižší než výsledky 4-MU assay, pravděpodobně kvůli substrátové inhibici.
Na základě LC/MSE byly vybrány dva unikátní peptidy a pro každý byly zvoleny dva nejintenzivnější MRM přechody.
Chromatogramy ukázaly koeluci 13C značených standardů se vzorkovými peptideiéry, což umožnilo přesnou kalibraci koncentrací.
Konverze měřených peptidových koncentrací na enzymatickou aktivitu odhalila, že fluorometrická metoda má tendenci aktivitu nadhodnocovat a že specifická aktivita chitotriosidázy se u jednotlivých pacientů liší vlivem genetických variant.
Na základě genomického sekvenování byla navržena nová biochemická assay s nižší průměrnou aktivitní hodnotou a lepší konzistencí s LC/MS výsledky.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá LC/MRM-MS/MS metoda nabízí vysokou selektivitu, reprodukovatelnost a schopnost multiplexního měření dalších proteinových markerů ve vzorcích pacientů.
Metoda představuje ekonomicky efektivní náhradu tradičních enzymových testů a poskytuje přesnější údaje o dávce enzymové terapie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Cílená proteomika s MRM přístupy se bude dále rozvíjet směrem k vysokopropustnému multiplexování klinických markerů.
Integrace dat-independent acquisition s pokročilými algoritmy strojového učení otevře cestu k objevování nových biomarkerů a personalizované medicíně.
Další vylepšení biochemických assay založených na genomicky podložených variantách enzymů zajistí přesnější diagnostiku a monitorování onemocnění.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace bezznačkových LC/MSE objevů a cílené LC/MRM-MS/MS kvantifikace poskytuje spolehlivý a přesný přístup k měření chitotriosidázy v plazmě.
Vybrané proteotypické peptidy a 13C značené interní standardy umožnily robustní absolutní kvantifikaci a odhalily limity konvenčních fluorometrických metod.
Vyvinutá metodika slouží jako platforma pro monitorování Gaucherovy choroby a rozšíření klinické proteomiky.

Reference

1. Aerts JMFG van Breemen MJ Bussink AP et al Biomarkers for lysosomal storage disorders: identification and application as exemplified by chitotriosidase in Gaucher disease Acta Paediatrica 97 2008 7–14
2. Hollak CEM van Weely S van Oers MHJ Aerts JMFG Marked elevation of plasma chitotriosidase activity a novel hallmark of Gaucher disease J Clin Invest 93 1994 1288–1292
3. Vissers JPC Langridge JI Aerts JMFG Analysis and quantification of diagnostic serum markers and protein signatures for Gaucher disease Mol Cell Proteomics 6 2007 755–766
4. Silva JC Gorenstein MV Li GZ Vissers JPC Geromanos SJ Absolute quantification of proteins by LCMS E a virtue of parallel MS acquisition Mol Cell Proteomics 5 2006 144–156