Online 2D-LC Characterization of Monoclonal Antibodies with Size Exclusion and Weak Cation Exchange Chromatography

Význam tématu

Detailní analýza kvality bioterapeutik, zejména monoklonálních protilátek, je klíčová pro zajištění jejich bezpečnosti a účinnosti. Agregace a variabilita náboje představují základní kritéria pro stabilitu a biologickou aktivitu látek.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo demonstrovat využití online 2D-LC spojení velikostní-exkluzní chromatografie (SEC) a slabě kationtové výměnné chromatografie (WCX) v jediné analýze. Metoda umožňuje simultánní kvantifikaci agregátů i profilování nábojových variant v čase kratším než 15 minut.

Použitá metodika a instrumentace

Pro 2D-LC se použil systém Agilent 1290 Infinity II 2D-LC s následujícími moduly:

• Agilent 1260 Infinity Bio-Inert Quaternary Pump (první dimenze)
• Agilent 1290 Infinity II High-Speed Pump (druhá dimenze)
• Agilent 1290 Infinity II Multisampler s chlazením (6 °C)
• Agilent 1290 Infinity II Multicolumn Thermostat (RT)
• Dva Agilent 1290 Infinity Valve Drives s multiple heart-cutting ventily (40 µL smyčky)
• Agilent 1290 Infinity Valve Drive pro 2D-LC (2 pozice/4 porty)
• Dva Agilent 1290 Infinity II Diode Array Detectory (10 mm buněčná vložka)

Použité kolony:

• Agilent AdvanceBio SEC 300 Å, 4,6 × 150 mm, 2,7 µm
• Agilent Bio MAb 4,6 × 50 mm, 1,7 µm, nonporózní

Software: Agilent OpenLab CDS ChemStation Edition C.01.07 a 2D-LC Software A.01.03.
Pufry a vzorek: 50 mM fosfátový pufr pH 6,2 spolu s NaCl pro eluci WCX, mAb roztok 10 mg/mL.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza odhalila přibližně 1 % agregátů před hlavní monomerovou formou. Pomocí heart-cutting 2D-LC bylo možné přesně oddělit hlavní monomer od agregátu a následně provést nábojové profilování. Ve druhé dimenzi byly identifikovány dvě kyselé a jedna bazická varianta. Měření sedmi opakování prokázalo vysokou přesnost retenčního času (RSD < 0,09 %) a plochy (RSD < 2,1 %). HiRes sampling potvrdil absenci koelujících příměsí.

Přínosy a praktické využití metody

Spojení SEC a WCX v jediném automatizovaném běhu eliminuje potřebu samostatných analýz, zkracuje dobu stanovení kvalitativních atributů a snižuje manipulaci se vzorky. Vysoká přesnost a citlivost přispívají k robustní kontrole kvality během vývoje i výroby.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření online 2D-LC o další chromatografické režimy, jako je afinitní nebo reverzní fáze, pro komplexní charakterizaci bioléčiv. Další vývoj softwarových nástrojů a miniaturizace modulů podpoří vyšší propustnost a integraci s hmotnostní spektrometrií.

Závěr

Metoda online 2D-LC SEC-WCX poskytuje souhrnnou a rychlou charakterizaci monoklonálních protilátek s vysokou přesností a rozlišením. Umožňuje efektivní monitoring klíčových kvalitatních atributů a představuje významný přínos pro biofarmaceutický výzkum a výrobu.

Reference

• ICH Topic Q6B, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products.
• Agilent, Access Newsletter, březen 2016.
• Du Y. et al. Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies. MAbs, 2012, 4(5), 578–585.
• Schneider S. Simple Method Optimization in mAb Charge Variant Analysis using pH Gradients Generated from Buffer Advisor with Online pH and Conductivity Monitoring. Agilent Application Note 5991-3365EN, 2014.