Online 2D-LC Characterization of Monoclonal Antibodies Using Protein A and Weak Cation Exchange Chromatography

Význam tématu

Charakterizace bioterapeutik je klíčová pro zajištění bezpečnosti a účinnosti monoklonálních protilátek. Komplexní hodnocení kvality vyžaduje sledování parametrů jako je titul, rozložení náboje, agregace či přítomnost nečistot. Tradiční metody jednorozměrné chromatografie jsou časově náročné a často neumožňují simultánní sledování více atributů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat kombinaci online 2D-LC metod: afinitní chromatografie na Protein A pro stanovení titru v první dimenzi a slabá kationtoměničová chromatografie (WCX) pro profilování nábojových variant ve druhé dimenzi. Využití vysokého rozlišení odběru vzorků mělo zajistit přesné a reprodukovatelné měření retence a plochy píků. Metoda byla testována na čisté roztoku mAb i na vzorku simulujícím procesní kontrolu s lysátem Escherichia coli.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda využívá sekvenční přepojení dvou chromatografických modulů Agilent 1290 Infinity II 2D-LC. První dimenze probíhá na monolitické koloně Protein A (Agilent Bio-Monolith, p/n 5069-3639) s gradientem PBS/acetic acid pro eluční odběr ve 7 částech vysokého rozlišení.
Druhá dimenze používá kolonu Agilent Bio mAb NP5 (2.1×50 mm, 5 µm) s gradientem amonného formiátu (pH 6,2) pro separaci nábojových variant.
Instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity Bio-Inert Quaternary Pump (G5611A)
• Agilent 1290 Infinity II High-Speed Pump (G7120A)
• Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B) s chlazením
• Agilent 1290 Infinity II Multicolumn Thermostat (G7116B)
• Agilent 1290 Infinity Valve Drive se dvěma multiple heart-cutting ventily (G4242-64000)
• 2× Agilent 1290 Infinity II Diode Array Detectors (G7117B) s buňkami Max-Light
• Software: Agilent OpenLAB CDS ChemStation C.01.07 a Agilent 1290 Infinity 2D-LC software A.01.03

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila rozdělení elučního píku z Protein A na sedm segmentů s vysokou přesností retence. Nábojový profil mAb odhalil dvě kyselé formy a hlavní pík. U první dimenze byla hodnota RSD retence 0,08 % a RSD plochy 0,8 %, u druhé dimenze < 0,25 % pro retenci a < 1,5 % pro plochu. Analýza mAb spiknutého do lysátu E. coli prokázala selektivitu afinity Protein A bez koeluce kontaminant.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost sledování titru i nábojových variant v jediném běhu šetří čas a redukuje pracovní postupy.
• Vysoká reprodukovatelnost podporuje spolehlivou kontrolu kvality (QA/QC) v bioprodukci.
• Online režim minimalizuje manipulaci se vzorkem a riziko kontaminace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření kombinací chromatografických principů (SEC, HIC, další afinitní módy).
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní charakterizaci posttranslačních modifikací.
• Automatizace vysokopropustných systémů pro screening tisíců vzorků.
• Využití strojového učení pro pokročilou analýzu 2D dat a predikci kvality produktu.

Závěr

Online 2D-LC metoda spojující afinitu Protein A a slabou kationtoměničovou chromatografii s vysokým rozlišením odběru vzorků představuje efektivní nástroj pro komplexní charakterizaci monoklonálních protilátek. Metoda nabízí vynikající přesnost, selektivitu a schopnost současného sledování více kvalitativních atributů, což umožňuje zkrácení analýz a podporu procesní kontroly ve vývoji a výrobě bioterapeutik.

Reference

• 1. Low D. et al. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B 2007, 848, 48–63.
• 2. Access Agilent Newsletter, August 2014.
• 3. Buckenmaier S. Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution for Multiple Heart-Cutting. Agilent Technologies App. Note 5591-5615EN, 2015.
• 4. Access Agilent Newsletter, March 2016.
• 5. Du Y. et al. Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies. MAbs 2012, 4(5), 578–585.