Mapping the Drug Conjugation Sites of an Antibody-Drug Conjugate

Význam tématu

Antibody–drug konjugáty (ADC) představují inovativní léčebný přístup spojující cílenou vazbu monoklonálních protilátek s vysoce cytotoxickými molekulami. Detailní určení míst konjugace léčiva na protilátce je klíčové pro kontrolu homogenity přípravku, bezpečnost, účinnost a dodržení regulačních požadavků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo vyvinout a demonstrovat plně automatizovaný workflow pro peptidové mapování ADC, konkrétně trastuzumab-DM1 (T-DM1). Kombinací automatizované přípravy vzorku (Agilent AssayMAP Bravo), vysoko­rozlišovací LC/MS analýzy (Agilent 1290 Infinity UHPLC + 6550 iFunnel Q-TOF) a softwaru BioConfirm bylo dosaženo komplexní charakterizace konjugovaných lysinů.

Použitá metodika a instrumentace

Automatizovaná digesce a analýza probíhala následovně:

• Příprava vzorku na Agilent AssayMAP Bravo: redukce DTT, alkylace jodoacetamidem, trávení trypsinem
• Reagencie: T-DM1 a Herceptin (20 mg/mL), trypsin, DTT, IAA, amoniový bikarbonát
• LC podmínky: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 kolona (2.1×100 mm, 1.8 µm), 0.1 % FA voda (A) / ACN (B), gradient 5–50 % B (0–16 min), až 90 % B (16–18 min), tok 0.5 mL/min, teplota 55 °C
• MS podmínky: pozitivní ESI, rozsah m/z 300–2000, MS/MS 100–2000, zdroj Jet Stream, fragmentor 250 V, dynamický rozsah 2 GHz
• Data processing: Agilent MassHunter BioConfirm – molekulární feature extraction, sekvenční matching s modifikacemi (alkylace, oxidace, deamidace, konjugace +956.3644 Da)

Hlavní výsledky a diskuze

Bylo identifikováno 35 unikátních peptidů nesoucích konjugované DM1.

• Celkové sekvenční pokrytí T-DM1: 98,7 % (44 lysinových reziduí)
• Potvrzeno 29 konjugovaných lysinů (20 na heavy, 9 na light chain)
• Dalších 5 míst bylo detekováno jako potenciální, přesné zmapování však nebylo možné
• 10 lysinů zůstalo nezměněno
• Reprodukovatelnost: u 22 peptidů CV < 10 %, u 9 peptidů 10–20 %, u 4 peptidů > 20 % (nízký signál)

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný a robustní workflow přináší:

• Rychlou a konzistentní přípravu vzorků pro vývoj a kontrolu kvality ADC
• Vysoce přesné a citlivé stanovení míst konjugace pro regulatorní dokumentaci
• Možnost porovnání různých šarží a optimalizace výrobního procesu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Rozšíření na jiné typy ADC a biokonjugátů
• Integrace alternativních enzymů pro lepší pokrytí obtížně stravitelných oblastí
• Vyšší stupeň automatizace a využití strojového učení pro interpretaci spekter
• Zvýšení throughputu pro testování většího počtu vzorků

Závěr

Navržený workflow spojuje automatizovanou digesci, vysoce výkonnou LC/MS analýzu a pokročilou softwarovou podporu a umožňuje detailní mapování konjugovaných míst ADC s vynikajícím sekvenčním pokrytím a reprodukovatelností.

Reference

Chen J, Zhu A. Mapping the Drug Conjugation Sites of an Antibody-Drug Conjugate Using Automated Sample Preparation and LC/MS Analysis. Agilent Technologies Application Note 5991-6389EN, November 2015.