Characterizing Antibody-Drug Conjugates and Assigning Drug Conjugation Sites

Význam tématu

Konjugáty protilátka-lék představují pokročilou třídu bioléčiv, která kombinují cílenou selektivitu monoklonálních protilátek s vysokou cytotoxicitou malých molekul. Jejich složitá struktura a heterogenita vyžadují špičkové chromatografické a hmotnostně-spektrometrické metody pro přesné určení poměru lék/protilátka, umístění konjugace a další kritické atributy kvality. Zvýšená chromatografická kapacita a citlivost MS zajišťují spolehlivou charakterizaci těchto komplexních molekul v oblasti výzkumu i rutinní kontroly kvality.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo ukázat, jak lze pomocí komplexního dvoudimenzionálního RPLC×RPLC (Agilent 1290 Infinity II 2D-LC) ve spojení s vysoce rozlišovací Q-TOF LC/MS (Agilent 6530) mapovat místa konjugace v ADC. Studie se zaměřila na dvě komerčně dostupné molekuly – ado-trastuzumab emtansine (Kadcyla) konjugovanou na lyzinových pozicích DM1 a brentuximab vedotin (Adcetris) konjugovanou na cysteinových pozicích MMAE.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala:

• Příprava vzorku: redukce DTT, alkylace IAA, tryptická digesce (poměr enzym/substrát 1:25, 16 h při 37 °C) ve vyváženém pufru s Rapigestem.
• 1. dimenze RPLC: ZORBAX Bonus-RP, pufr NH4HCO3 pH 8.2 vs MeOH/ACN, dlouhý gradient 45 min.
• 2. dimenze RPLC: Eclipse Plus C18, kyselina fosforečná nebo formiová ve vodě vs ACN, modulovaný gradient, smyčky 2×40 µL.
• Detekce UV při 214, 248 a 252 nm a MS s technologií Jet Stream, režim all-ions MS/MS (2 GHz, rozlišení 10 000), sběr spekter při kolizní energii 20 a 40 eV.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II 2D-LC Solution (High Speed Pump, Multisampler, Thermostat, Valve Drive, duo-valve)
• Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight LC/MS system
• OpenLAB CDS ChemStation s 2D-LC add-on, MassHunter (instrument control, data analysis, BioConfirm), GC Image LC×LC

Hlavní výsledky a diskuse

RPLC×RPLC UV mapy odhalily v případě Kadcyly nárůst intenzity v oblasti hydrofobních peptidů, což koresponduje s konjugací DM1. Extrahovaná iontová chromatogramy při m/z 547.2206 (fragment DM1) v all-ions MS/MS mapách umožňují selektivní lokalizaci konjugovaných peptidů. MS/MS analýza přinesla vysokou přesnost při přiřazení lyzinových pozic konjugace v lehkém i těžkém řetězci.
U Adcetris byla identifikována konjugace MMAE na inter- i intrachain cysteiny (např. peptid NQVSLTCLVK), přičemž detekce vedlejších výrobků ukázala i nečekanou redukci intrachain můstků. UV při 248 nm a extrahovaný fragment m/z 718.5113 potvrdily místa konjugace a heterogenitu distribučních druhů.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená chromatografická kapacita 2D-LC poskytuje detailní separaci peptidů, což umožňuje detekci nízkorychlotných konjugovaných druhů.
• All-ions MS/MS režim odstraňuje omezení selektivního izolačního okna a zachycuje všechny fragmenty léku najednou.
• Komplexní workflow je vhodné pro vývoj, validaci a rutinní QA/QC procesy u výrobních i klinických ADC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj směruje ke zkracování analýz při zachování selektivity pomocí rychlejších sloupců a optimalizovaných modulací gradientů. Integrace umělé inteligence pro automatické vyhodnocování míst konjugace a kvantifikačního rozboru DAR (drug-to-antibody ratio) může dále zefektivnit vývoj ADC. Také rozšíření na jiné formáty bioléčiv, komplexní glykanální a posttranslační modifikace otevírá nové aplikace dvoudimenzionálních postupů.

Závěr

Prezentovaná kombinace Agilent 1290 Infinity II 2D-LC a Agilent 6530 Q-TOF LC/MS nabízí vysoce precizní platformu pro lokalizaci míst konjugace a charakterizaci heterogenity ADC. Metoda je dostatečně robustní a citlivá pro aplikační nasazení ve výzkumu i průmyslové kontrole kvality.

Reference

1. Sandra K., Vandenheede I., Sandra P. J. Chromatogr. A 2014, 1335, 81–103.
2. Fekete S. et al. Anal. Chem. 2016, 88, 480–507.
3. Panowski S. et al. mAbs 2014, 6, 34–45.
4. Wakankar A. et al. mAbs 2011, 3, 161–172.
5. Beck A., Reichert J. M. mAbs 2014, 6, 15–17.
6. Sandra K., Sandra P. Bioanalysis 2015, 7, 2843–2847.
7. Sandra K. et al. J. Chromatogr. B 2016, 1032, 119–130.
8. Vanhoenacker G. et al. Anal. Bioanal. Chem. 2015, 407, 355–366.
9. Vanhoenacker G. et al. Agilent Application Note 5991-2880EN, 2013.
10. Vanhoenacker G. et al. Agilent Application Note 5991-4530EN, 2014.
11. Sandra K. et al. Agilent Application Note 5991-8077EN, 2016.