Screening, Identifying, and Quantifying Potential Genotoxic Compounds Using High Resolution LC/MS

Význam tématu

Genotoxické nečistoty v léčivých látkách představují významné riziko pro bezpečnost pacientů.
Rychlé a spolehlivé metody pro screenování, identifikaci a kvantifikaci těchto sloučenin usnadňují dodržení regulačních požadavků a minimalizují čas náročný na laboratorní analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rutinní workflow pro batch-to-batch analýzu chlorhexidinu s možností detekce, identifikace a kvantifikace potenciálně genotoxických látek.
Hlavní kroky zahrnovaly degradaci vzorku, screening pomocí vysokorozlišovací LC/MS, statistickou diferenciální analýzu, identifikaci pomocí databáze a potvrzení s kvantifikací All Ions MS/MS.

Použitá instrumentace

Chromatografie:

• Agilent 1290 Infinity II LC System (binary)
• Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD, 3,0×50 mm, 1,8 µm
• Teplota kolony 40 °C, průtok 0,5 mL/min
• Mobilní fáze: 0,1 % kyselina formiová ve vodě (A) a methanolu (B)

Hmotnostní spektrometrie:

• Agilent 6545 Accurate-Mass Q-TOF s Jet Stream zdrojem
• Teplota nosného plynu 250 °C, průtok 11 L/min; stuha plynu 200 °C, 11 L/min; kapilární napětí 2 500 V
• Fragmentor 120 V, skimmer 40 V, collison energie 0, 10 a 20 eV
• Akvizice 5 spekter/s, referenční hmotnosti m/z 64,0158 a 922,0098

Použitá metodika

Vzorky chlorhexidinu (1 000 µg/mL) byly degradovány přídavkem 100 % kyseliny formiové a zchlazeny na 80 °C po dobu 1 h.
Při screeningové analýze byly odebrané vrcholy diverterem vedeny do odpadu mimo okno 7,4 min.
Data byla zpracována v Agilent MassHunter Mass Profileru: extrakce molecular features, filtry kvality (> 4 000 counts, kvalita 100), > 4× změna.
Statistická diferenciální analýza (Studentův t-test, PCA) identifikovala rysy významně odlišné od kontrolních vzorků.
S využitím ID Browseru byly tyto rysy porovnány s custom databází potenciálních genotoxických impurit.
Pro potvrzení a kvantifikaci byl aplikován režim All Ions MS/MS: extrakce fragmentárních i prekurzorových iontů, vyhodnocení koeluce a shody s MS/MS knihovnou.
Kvantifikace proběhla v MassHunter Quantitative Analysis na základě kalibrace 0,1–300 ng/mL.

Hlavní výsledky a diskuse

Diferenciální analýza odhalila v degradovaných vzorcích několik rysů s log2 fold > 3, nejvýznamnější byl 4-chloroanilin.
Potvrzení ve vysokorozlišovací MS/MS prokázalo koeluci prekurzorových a fragmentárních iontů, koeficient čistoty píku > 98 %.
Metoda dosáhla LOQ < 1 ng/mL a lineární rozsah přes 3 řády velikosti (0,1–300 ng/mL, R² > 0,998).
Koncentrace 4-chloroanilinu v testovaném vzorku činila přibližně 29 ng/mL (0,02 %), tedy pod regulačním limitem 0,05 %.

Přínosy a praktické využití metody

Navržené workflow umožňuje rychlý screening a kvantifikaci známých genotoxických impurit v substuancích a formulacích léčiv.
Automatizované zpracování dat a statistická filtrace snižují potřebu manuálního zásahu a zkracují dobu analýzy.
Vysoká citlivost a robustnost Q-TOF all-ions MS/MS usnadňuje kontrolu kvality při výrobních šaržích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření databází genotoxických látek a integrace umělé inteligence pro automatickou identifikaci nových nečistot.
Adaptace metod na další typy výroby, včetně pevných forem a komplexních matric.
Implementace multi-omics přístupů pro širší profilování bezpečnostních rizik léčiv.

Závěr

Studie představila kompletní workflow pro screening, identifikaci a kvantifikaci genotoxických sloučenin v chlorhexidinu.
Kombinace statistické diferenciální analýzy, vlastních databází a režimu All Ions MS/MS poskytuje rychlou, citlivou a opakovatelnou metodu pro kontrolu kvality léčivých látek.

Reference

EMA Guidance on the limits of genotoxic impurities, EMEA/CHMP/QWP/251344/2006