Agilent LC/Q-TOF and Mass MetaSite Software for Seamless Metabolite Identification

Význam tématu

Identifikace metabolit hraje zásadní roli v raných fázích vývoje léčiv. Přesné stanovení struktur vzniklých metabolitů z biologických matric pomáhá pochopit farmakokinetiku, toxicitu a optimálně navrhnout další kroky výzkumu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje integrovaný pracovní postup pro predikci a identifikaci metabolitů warfarinu z inkubátů potkaních hepatocytů. Kombinuje vysoce citlivou chromatografii LC/Q-TOF s pokročilým softwarem Mass MetaSite.

Použitá metodika

Vzorky vznikly inkubací ratích hepatocytů s 30 μM racemického warfarinu po dobu 24 hodin. Reakce byla ukončena dvouobjemovým přídavkem acetonitrilu, poté následovalo centrifugování a analýza supernatantu. Chromatografie probíhala na Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl Hexyl kolonce za použití gradientu formiátové kyseliny a methanolu.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity Binary Pump G4220A
• Agilent 1290 Infinity Autosampler G4226A
• Agilent 1290 Infinity Thermostat G1330B
• Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment G1316C
• Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl Hexyl, 2.1 × 150 mm, 1.8 µm
• Agilent 6550 Q-TOF Mass Spectrometer s AJS thermal gradient focusing
• Agilent MassHunter Workstation B.05.01

Hlavní výsledky a diskuse

Software Mass MetaSite předpověděl pět možné hydroxywarfarinových metabolitů s odhadovanou pravděpodobností vzniku. LC/Q-TOF analýza prokázala tři hydroxyderiváty. Díky vysoké hmotnostní přesnosti (<3,5 ppm) a detailním fragmentačním vzorcům byla jedna chromatografická stopa jednoznačně přiřazena jako 4-hydroxywarfarin. Zbylé dva izomery nelze rozlišit na základě charakteristických fragmentů, mohou se však jednat o 6-, 7- nebo 8-hydroxywarfarin.

Přínosy a praktické využití metody

Kombinace vysoce rozlišené LC/Q-TOF spektrometrie a prediktivního softwaru umožňuje rychlou a spolehlivou identifikaci primárních metabolitů bez nutnosti dostupnosti standardů. Tento systematický přístup podporuje rozhodování v raných fázích vývoje léčiv a usnadňuje hodnocení metabolické stability.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj prediktivních algoritmů by mohl zahrnovat fázi konjugace či detekci reaktivních metabolitů. Integrace s vysokopropustným screeningem a pokročilou analýzou dat umožní výrazné zrychlení ADME popisu kandidátních sloučenin.

Závěr

Popisovaná metodika ukazuje efektivní workflow spojující Agilent LC/Q-TOF instrumentaci a Mass MetaSite software pro důkladnou identifikaci a strukturální přiřazení metabolitů. Tento přístup zvyšuje důvěru ve výsledky a podporuje lepší design a výběr nových farmaceutických látek.

Reference

• 1. Miller GP, Jones DR, Sullivan SZ et al Assessing cytochrome P450 and UDP glucuronosyltransferase contributions to warfarin metabolism in humans Chem Res Toxicol 2009 22 1239
• 2. Zhi Yi Zhang LC MS MS warfarin assay – An emerging tool for the early detection of cytochrome P450 associated drug drug interactions in drug discovery Spectroscopy 17 2003 491-502
• 3. Regalado EL et al Chromatographic resolution of closely related species separation of warfarin and hydroxylated isomers J Chromatogr A 2013 1314 266-275