Drug Metabolite Purification and Identification

Význam tématu

Purifikace a charakterizace metabolitů jsou klíčové fáze studií DMPK (drug metabolism and pharmacokinetics), protože umožňují ověření struktur metabolitů, podporují toxikologické testy a poskytují podklady pro NMR konfirmaci ve vývoji léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Tato Application Note popisuje workflow pro izolaci a identifikaci metabolitů bupropionu vzniklých in vitro inkubací s lidskými játrovými mikrosomy. K purifikaci byla použita zařízení Agilent 1260 Analytical-scale Purification System s Automated Purification Software a ke strukturní identifikaci Agilent 6540 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS společně s Mass-MetaSite Software.

Použitá metodika a instrumentace

Inkubační roztok bupropionu (250 µM) s lidskými játrovými mikrosomy a NADPH při 37,5 °C po 120 minutách byl ukončen přidáním 6 % kyseliny mravenčí a vyčištěn centrifugací. Supernatant byl podroben vakuové evaporaci a rekonstituci pro frakcionaci.

• Agilent 1260 Analytical-scale Purification System (čtyřsolventové čerpadlo, autosampler, kolona Compartment, VWD detektor, fraction collector)
• Agilent 6150 Single Quadrupole LC/MS pro MS spuštěnou frakcionaci
• Agilent 6540 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS pro HRAM a MS/MS analýzy
• OpenLab CDS ChemStation Edition a Automated Purification Software pro řízení systému a škálování gradientů

Hlavní výsledky a diskuse

UV a MS profilování odhalilo hlavní metabolity: hydroxybupropion (m/z 256) a stereoisomery erytro/threo-bupropionu (m/z 242). Peak-based frakcionace pro m/z 256 s využitím fokusovaného gradientu umožnila izolaci ~0,05 µg metabolitu na jednu injekci.
Time-based frakcionace se sběrem 0,1min úseků zachytila minoritní stereoisomery erytro/threo formy. MS/MS fragmentační data potvrdila klíčové produktové ionty (m/z 166, 238) a Mass-MetaSite navrhl lokalizace hydroxylu na tert-butylové skupině.

Přínosy a praktické využití metody

Popisovaný postup umožňuje snadné přepínání mezi analytickým a semipreparativním módem, zbavuje vzorky matrice, zvyšuje výtěžek a vhodný je jak pro izolaci hlavních, tak stopových metabolitů připravených k následným NMR nebo toxikologickým studiím.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj automatizace a integrace umělé inteligence pro návrh gradientů, online spojení preparativní chromatografie s HRMS detekcí v reálném čase, mikrorezervoárové frakcionace pro screening a vyšší propustnost analýz.

Závěr

Workflow založené na Agilent platformách pro purifikaci a identifikaci bupropionových metabolitů prokázalo vysokou flexibilitu, škálovatelnost a spolehlivost v přípravě vzorků pro hlubší strukturální a toxikologické studie.

Reference

1. Peak-based fraction collection with the Agilent 1100 Series purification system AS – Influence of delay volumes on recovery, Agilent Technologies Technical Note, 5988-5746EN.
2. Analytical to Preparative HPLC Method Transfer, Agilent Technologies Technical Note, 5991-2013EN.
3. Barros Jr. A. et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 2011, 54, 979–986.
4. Faucette S.R. et al., Drug Metab. Dispos. 2001, 29, 1123–1129.
5. Wang X. et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 2012, 70, 320–329.