Agilent Hybrid SFC/UHPLC-Triple Quadrupole System for Achiral and Chiral Metabolite Analysis

Význam tématu

Warfarin je široce používané antikoagulans. Jeho oxidativní metabolity se v organismu vyskytují ve více stereo- a regioizomerních formách, které mohou vykazovat odlišnou farmakologickou aktivitu i toxicitu. Precizní rozlišení achirálních i chirálních isomerů těchto metabolitů je proto klíčové pro spolehlivou bioanalytickou charakterizaci, monitorování léčby a bezpečnostní studie.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo demonstrovat flexibilitu hybridního systému Agilent 1260 Infinity SFC/UHPLC spojeného s triple kvadrupólem 6460 pro automatické přepínání mezi reverzní fází (RPLC) a superkritickou kapalinovou chromatografií (SFC). Studie představuje vývoj citlivé a validované metody pro simultánní achirální i chirální analýzu warfarinu a jeho pěti hydroxymetabolitů s dosažením sub-nanomolární citlivosti.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Achirální RPLC separace na sloupci ZORBAX Eclipse Plus Phenyl Hexyl s gradientem methanol/voda + 0,05 % kyseliny mravenčí.
• Achirální SFC separace na sloupci ZORBAX RX-SIL s mobilní fází CO₂ a modifikátorem methanol/5 mM amonný formiát + 0,1 % kyseliny mravenčí.
• Chirální SFC analýza na sloupci CHIRALPAK OD-3, případně sériové propojení s RX-SIL pro optimální rozlišení isomerů.
• Automatické přepínání mezi RPLC a SFC režimem pomocí 2-pozicového/10-portového ventilu řízeného softwarem MassHunter.
• Detekce selektivními MRM přechody na Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS s ESI zdrojem Jet Stream v pozitivním režimu.

Instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity Hybrid SFC/UHPLC (G4309A) s modulem SFC, přidanou UHPLC pumpou G4220A, autosamplerem a DAD detektorem.
• Termostatovaný sloupcový box s 2-pozicovým/6-portovým rozbočovačem pro rychlou výměnu sloupců.
• Make-up pumpa, průtokový splitter a zpětnotlakový regulátor pro optimalizaci ionizace v SFC režimu.
• Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS (G6460A) s ESI+ zdrojem a MRM akvizicí.

Hlavní výsledky a diskuse

Achirální RPLC i SFC separace dosáhly vynikající chromatografické rozlišení warfarinu a jeho pěti hydroxymetabolitů. Chirální SFC na jednom sloupci OD-3 rozlišila většinu enantiomerních párů, sériové propojení se sloupcem RX-SIL jejich separaci dále zvýraznilo. Validovaná metoda dosáhla LOD pod 0,15 nM a LOQ pod 0,3 nM, linearita pokrývá čtyři řády koncentrací s korelačním koeficientem R² ≥ 0,99. Retenční doby vykazují RSD < 0,2 % a plochy píků RSD < 5 % (LOQ < 10 %). Analýza hepatocytových inkubací potvrdila tvorbu významných hladin 4’-, 6- a 7-hydroxymetabolitů a nižších hladin 8- a 10-hydroxywarfarinu po 24 h.

Přínosy a praktické využití metody

• Jeden přístroj umožňuje přepínání mezi RPLC a SFC bez fyzické rekonstrukce, čímž se šetří čas a eliminuje riziko chyb.
• Simultánní achirální i chirální analýza z jednoho vzorku zvyšuje efektivitu vývoje bioanalytických metod.
• Subnanomolární citlivost a vysoká selektivita umožňují spolehlivé sledování stopových metabolitů v komplexních biologických matricích.

Budoucí trendy a možnosti využití

SFC/UHPLC hybridní systémy se stávají standardem pro bioanalytiku díky své ortogonalitě a rychlosti analýzy. Integrace s vysokorozlišujícími MS technikami (HRMS, IMS) nabídne detailnější strukturační informace. Další rozvoj softwarové automatizace a inteligentní ventilace sloupců přinese vyšší propustnost a flexibilitu laboratorních prací.

Závěr

Hybridní Agilent 1260 Infinity SFC/UHPLC spojený s triple kvadrupólem 6460 představuje robustní platformu pro rychlou a citlivou achirální i chirální analýzu warfarinu a jeho hydroxylovaných metabolitů. Automatické přepínání režimů a vynikající chromatografická ortogonalita zajišťují efektivní a spolehlivou bioanalytickou metodiku.

Reference

1. Jones D. R.; Miller G. P. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 2011, 7(7), 857–874.
2. Kaminsky L. S.; Zhang Z. Y. Pharmacol. Ther. 1997, 73, 67–74.
3. Jones D.; Moran J. H.; Miller G. P. Drug Metab. Rev. 2010, 42, 55–61.
4. Agilent 1260 Infinity Analytical Hybrid SFC/UHPLC System, User Manual, 2015.