BIOMOLECULE CHARACTERIZATION WORKFLOW - AGILENT BIO-MONOLITH PROTEIN A AND PROTEIN G AFFINITY COLUMNS

Význam tématu

Chromatografická charakterizace bílkovin je zásadní pro zajištění kvality terapeutických protilátek a pro výzkum biologických vzorků.
Efektivní rozdělení a detekce monoklonálních protilátek usnadňuje rychlou analýzu čistoty a vazebných vlastností.
Urychlené metody přispívají k vyšší propustnosti laboratoří a zkracují dobu vývoje biolékových produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem dokumentu je prezentovat doporučenou konfiguraci LC systému a univerzální chromatografickou metodu s použitím sloupců Agilent Bio-Monolith Protein A a Protein G.
Metoda slouží jako výchozí bod pro další optimalizaci separace podle specifických požadavků na rozlišení a rychlost analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

• LC systém: Agilent 1260 Infinity Bio-Inert Quaternary LC
• Injektor: G5667A, objem injekce 1–5 µL (max. 50 µL pro vysoké zatížení vzorku)
• Pumpa: G5611A, průtok 1,0–3,0 mL/min (optimum 1,0 mL/min pro vyšší výšku píků)
• Kolonová komora: G1316C, teplotní rozsah 4–40 °C (standardně 25 °C)
• Detekce: UV při 280 nm (G1315C)
• Kolony: Bio-Monolith Protein A a Protein G s barevným značením (bílý a žlutý pruh)
• Mobilní fáze A: 50 mM fosfátový pufr, pH 7,4; mobilní fáze B: eluční pufry (citráty, glycin, octová kyselina, HCl) dle pH a koncentrace

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožňuje rychlou separaci imunoglobulinů s průtoky až 3,0 mL/min, přičemž optimální poměr rychlosti a rozlišení je dosažen při 1,0 mL/min.
Grafy ukazují ostré a reprodukovatelné píky IgG3 při různé rychlosti průtoku a gradientních programech.
Sloupce Protein A vykazují vysokou vazebnou kapacitu pro většinu lidských IgG, sloupce Protein G doplňují vaznost u forem s nižším komerčním zásahem.
Tabulky afinit uvádějí relativní vazebné síly pro různé třídy a podtřídy protilátek, umožňují zvolit vhodný typ kolony pro konkrétní analýzu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a robustní separace bílkovin s minimální údržbou kolony
• Flexibilita v nastavení pH a výměně elučních pufrů pro optimalizaci vazby a eluce
• Vhodné pro kvantitativní a kvalitativní kontrolu monoklonálních protilátek
• Kompatibilita se standardními HPLC/UHPLC systémy bez nutnosti speciálních úprav

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření monolitických materiálů pro další biomolekuly, včetně receptorů a enzymů.
Propojení s MS detekcí a automatickými platformami pro vysokopropustné screeny.
Vývoj nových afinitních pufrů a modulárních sloupců pro cílenou separaci vzorků s nízkou koncentrací.

Závěr

Popsaná metoda poskytuje univerzální a rychlou platformu pro charakterizaci bílkovin pomocí sloupců Agilent Bio-Monolith Protein A a G.
Díky jednoduché konfiguraci LC systému a variabilním podmínkám elučních pufrů lze metodu snadno přizpůsobit různým analytickým požadavkům.

Reference

• Richman DD, Cleveland PH, Oxman MN, Johnson KM. The binding of Staphylococci protein A by the sera of different animal species. J Immunol. 1982;128:2300-2305.
• Frank MB. Antibody Binding to Protein A and Protein G beads. In: Frank MB, editor. Molecular Biology Protocols. Oklahoma Medical Research Foundation; 1997.