Urinary Vanillylmandelic, Homovanillic, and 5-Hydroxyindoleacetic Acids by LC/MS/MS

Význam tématu

Analýza metabolitů neurotransmiterů vanillylmandelové kyseliny (VMA), homovanilové kyseliny (HVA) a 5-hydroxyindol-3-octové kyseliny (5-HIAA) v moči je klíčová pro diagnostiku neuroendokrinních poruch a poruch katecholaminové metablizace. Rychlá a spolehlivá metoda umožňuje v klinické praxi přesné stanovení biomarkerů bez komplikovaných kroků přípravy vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout citlivou a specifickou LC/MS/MS metodu pro simultánní kvantifikaci VMA, HVA a 5-HIAA v moči s jednoduchou přípravou vzorku ředěním. Metoda měla zajistit široký dynamický rozsah, reprodukovatelnost a výbornou linearitu kalibrace.

Použitá metodika a instrumentace

Příprava vzorku spočívala v 1:10 ředění moče 0,2% kyselinou mravenčí ve vodě, následném odstředění nebo filtraci. Chromatografie probíhala na Agilent 1290 Infinity LC s penta­fluorofenylovou kolonkou (2×150 mm, 3 μm) při 40 °C. Mobilní fáze A: voda s 0,2% kyselinou mravenčí, B: methanol; gradient od 15 % B do 95 % B. Detekce hmotnostní spektrometrií na Agilent 6460 Triple Quadrupole MS s technologií Jet Stream ESI, monitorovány kvantifikační a kvalifikační MRM přechody s deuterovanými interními standardy.

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární oblast metody pokrývala 0,078–100 mg/L pro všechny tři anality s koeficientem determinace R2 > 0,9998. Intradení i interdnení reprodukovatelnost byla v rozsahu CV < 6 %. Matricové efekty činily 91–93 %, avšak díky korekci interními standardy dosáhly přesnosti 94–115 %. Kontrola kvality Bio-Rad Lyphocheck prokázala hodnoty v souladu s uvedenými intervaly a CV < 6 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimální nároky na přípravu vzorku bez extrakce nebo SPE.
• Vysoká citlivost a selektivita díky MRM přechodům.
• Široký dynamický rozsah vhodný pro klinické i výzkumné účely.
• Využití deuterovaných interních standardů zajišťuje přesnost i v komplikovaných matricích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze dále rozšířit o další biologické matrixy či analyty neurotransmiterů. Automatizace přípravy vzorků a integrace do klinických robotických linek umožní vyšší průchodnost vzorků. Vývoj vysokozdvižné chromatografie a zdokonalení MS detekce povede k ještě citlivějšímu monitoringu nízkokoncentrovaných metabolitů.

Závěr

Vyvinutá LC/MS/MS metoda pro simultánní stanovení VMA, HVA a 5-HIAA v moči nabízí jednoduchou přípravu vzorku, výbornou linearitu, citlivost i reprodukovatelnost. Díky tomu je vhodná pro rutinní klinickou diagnostiku i výzkumné aplikace.

Použitá instrumentace

• LC: Agilent 1290 Infinity Binary Pump, Well-plate sampler, kolonka Agilent Pursuit PFP 2×150 mm, 3 μm
• MS/MS: Agilent 6460 Triple Quadrupole s technologií Jet Stream ESI
• Softwarové vybavení: Agilent MassHunter B.06.00 Quantitative Analysis

Reference

– Agilent Technologies Application Note 5991-6053EN, 2016.