Urinary Catecholamines, Metanephrines, and 3-Methoxytyramine in a Single LC/MS/MS Run

Význam tématu

Měření katecholaminů a jejich metabolitů v moči je klíčové pro diagnostiku endokrinních onemocnění, například feochromocytomu, a pro monitorování léčby. Použití LC/MS/MS zaručuje vysokou citlivost, selektivitu a možnost simultánního stanovení více analyzovaných látek v jednom běhu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout rychlou, citlivou a specifickou metodu pro kvantifikaci dopaminu, epinefrinu, norepinefrinu, metanefrinu, normetanefrinu a 3-methoxytyraminu v moči. Jednotlivé sloučeniny měly být extrahovány v jediném SPE kroku a analyzovány jedním LC/MS/MS během.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity LC Binary Pump s termostatovaným well-plate samplerem
• Agilent Pursuit PFP kolona (2 × 150 mm, 3 μm) s PFP guard kolonkou
• Agilent Bond Elut Plexa SPE kazety (30 mg, 3 mL)
• Agilent 6460 Triple Quadrupole Mass Spectrometer s technologiemi Jet Stream ESI+
• Software Agilent MassHunter B.06.00

Použitá metodika

• Příprava vzorku: 0,5 mL moče, přidání deuterovaných interních standardů a diphenylboronátového činidla, úprava pH na 7,5–9,5
• SPE extrakce: kondicionování kazety, naložení vzorku, mytí vodným pufrem a 5 % methanolem, eluce 5 % kyselinou mravenčí
• LC podmínky: mobilní fáze voda s 0,2 % formic acid a methanol, gradientní eluce, průtok 0,3 mL/min, teplota kolony 40 °C, objem injekce 20 μL
• MS/MS detekce: MRM přechody pro kvantifikaci i kvalifikaci, ESI+ režim, optimalizace teploty, plynných proudů a napětí, korekce pomocí deuterovaných standardů
• Vyhodnocení dat: Agilent MassHunter Quantitative, vážená lineární regrese 1/x, kalibrace s hodnotou R2 nad 0,9997

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografické rozlišení všech analyzovaných látek prokázalo dostatečné oddělení isobarických párů (epinefrin/normetanefrin, metanefrin/3-methoxytyramin).
• Absolutní výtěžnost SPE se pohybovala mezi 53 a 112 %, po korekci interními standardy relativní výtěžnost dosáhla 94–104 %.
• Lineární rozsah: katecholaminy 1,56–1 000 ng/mL, metanefriny a 3-methoxytyramin 4,69–3 000 ng/mL, všechny kalibrace s R2 > 0,9997.
• Precize a přesnost: intradení i mezidení CV < 6 %, přesnost v rámci ± 8 % napříč koncentracemi.
• Kontrolní vzorky Bio-Rad Lyphocheck ukázaly výsledky v souladu s referenčními hodnotami stanovenými HPLC.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoduchá, robustní a rychlá příprava vzorku.
• Simultánní stanovení šesti klíčových analytů v jednom běhu šetří čas a zdroje.
• Vysoká citlivost a reprodukovatelnost vhodné pro klinické laboratoře i výzkum.
• Široký dynamický rozsah umožňuje sledovat jak nízké, tak vysoké koncentrace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace SPE kroků pro zvýšení propustnosti a konzistence.
• Integrace vysoce odlišovací hmotnostní spektrometrie pro rozšíření analytického panelu.
• Rozvoj multiplexních metod pro širší spektrum metabolitů.
• Využití v personalizované medicíně, farmakokinetických studiích a monitorování terapie.

Závěr

Vyvinutá LC/MS/MS metoda s jedinou SPE extrakcí poskytuje robustní, selektivní a vysoce citlivé stanovení katecholaminů, metanefrinů a 3-methoxytyraminu v moči. Metoda splňuje přísná kritéria lineárity, přesnosti a precize, což ji činí vhodnou pro klinický výzkum i diagnostické aplikace.

Reference

1. Whiting MJ. Simultaneous measurement of urinary metanephrines and catecholamines by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection. Ann Clin Biochem. 2009;46:129–136.
2. Talwar D, et al. Extraction and separation of urinary catecholamines as their diphenyl boronate complexes using C18 solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B. 2002;769:341–349.
3. Dr. Wéber Consulting KFT. Extraction of Catecholamines from Urine, AN1071A. Göd-Felsögöd, Hungary.