I Knew You Were Trouble: Trials and Tribulations of Method Development for Extended Pathway, Low-Volume, Plasma Catecholamine Assay by LC-MS/MS

Význam tématu

Plazmatické katecholaminy a jejich metabolity hrají klíčovou roli v nervové regulaci, ovlivňují kardiovaskulární funkce a chování. Jejich nízké koncentrace a hydrofilní charakter komplikují analytické stanovení, zvláště při omezeném objemu vzorku. Vyvinutí citlivé metody pro více než tuctu sloučenin najednou je zásadní pro neurochemické studie, klinickou diagnostiku a farmakologický výzkum.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout a optimalizovat LC-MS/MS metodu pro simultánní kvantifikaci 18 katecholaminů, prekurzorů a jejich metabolitů v malém objemu lidské plazmy. Studie se zaměřila na zvýšení retenční síly, separaci čtyř párů izobarů a minimalizaci objemu vzorku bez zásadní ztráty citlivosti.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek plazmy byl navozen směsí standardů 18 analyzovaných sloučenin. Po předúpravě bylo do LC systému Agilent 1290 Infinity II (UHPLC) vřazeno kolonu Poroshell 120 EC-C18 (2,1×100 mm, 1,9 μm). Mobilní fáze A tvořila voda s 0,1 % kyseliny mravenčí, fáze B methanol. Injekční objem činil 5 μl, teplota kolony 55 °C, průtok 0,3 ml/min, gradientní eluce za 9,5 minuty. Detekce probíhala na triple kvadrupolu Agilent 6495C nebo Ultivo v režimu MRM. Pro optimalizaci rozlišení izobarů byly do injekčních vial přidány iontově-párovací činidla (sulfonové kyseliny C4–C8).

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace chromatografie prokázala, že hexansulfonová kyselina nejlépe vyvažuje zvýšenou retenci a minimální potlačení signálu vstupních látek. Přidané činidlo lze po vložení do vial snadno vypláchnout z přístroje během jedné hodiny, což umožňuje rychlý přechod mezi metodami. Standardní SPE s PBA sorbentem však nevyhověl pro některé metabolity, což vyvolalo potřebu alternativních příprav.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost vyšetřit rozsáhlé biochemické dráhy katecholaminů v jedné analýze.
• Nízký vzorkový objem šetří cenný biologický materiál.
• Rychlá doba analýzy (~12 minut) s vysokou selektivitou MRM.
• Flexibilní přepínání mezi aplikacemi díky snadnému odstranění iontově‐párovacího činidla.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj by mohl směřovat k chemickým derivatizacím pro zvýšení citlivosti, zavedení optimalizovaného SPE pro rozšířenou sadu metabolitů, využití mikrokolonek či nanoLC pro snížení spotřeby vzorku a využití této metodiky v klinických laboratořích i farmakokinetických studiích.

Závěr

Prezentovaná metoda rozšiřuje možnosti analýzy katecholaminového metabolického profilu v malém objemu plazmy s rozumným kompromisem mezi retencí, separací izobarů a citlivostí. Optimalizace iontově‐párovacího přístupu otevírá cestu k aplikacím ve výzkumu neurochemie a klinické diagnostice, přičemž další úpravy vzorkové přípravy a derivatizace mohou dále zlepšit výkonnost metody.

Reference

• Analysis of Catecholamines in Urine by Unique LC/MS Suitable Ion-pairing Chromatography - Marianne L. Bergmann et al., Journal of Chromatography B, April 2017