Extraction of Acidic Catecholamine Metabolites in Plasma Using ISOLUTE® SLE+ Prior to LC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Extrakce kyselých metabolitů katecholaminů z plazmy je klíčová pro spolehlivou bioanalytickou kvantifikaci v klinických i farmakokinetických studiích.
Metoda podporované liquid–liquid extrakce (SLE+) minimalizuje vznik emulzí, zajišťuje vysoké výtěže a čisté vzorky pro LC–MS/MS detekci.

Cíle a přehled studie / článku

Popisuje se protokol použití destiček ISOLUTE SLE+ pro extrakci vanillylmandelové kyseliny, homovanilové kyseliny a 5-hydroxyindol-3-octové kyseliny z lidské plazmy.
Hlavním cílem je dosáhnout reproducibilních výtěžků nad 80 %, nízké variace (RSD < 5 %) a lineárního rozsahu analytů od 2 do 200 ng/mL před kvantifikací pomocí LC–MS/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Postup sample preparation:

• Smíchání 75 µL plazmy s 75 µL 100 mM amonného acetátu pH 7 obsahujícího vnitřní standardy (D3-VMA, D5-HVA, D5-5-HIAA).
• Nanesení 150 µL této směsi na ISOLUTE SLE+ 200 µL destičku a rovnoměrné rozložení.
• Promíchání a zasazení pod tlakem (2–5 psi) po dobu 5 min.
• Eluce 250 µL 1 % kyseliny mravenčí v ethylacetátu a následně 300 µL čistého ethylacetátu.
• Vysušení eluátu v proudu vzduchu nebo dusíku při 30 °C a reconstituce 200 µL 0,1 % kyseliny octové v 10 % acetonitrilu.

Instrumentace:

• Podporovaná extrakce: ISOLUTE SLE+ 200 µL destička (Biotage).
• Manifold: Biotage PRESSURE+96 pozitivní tlaková jednotka.
• Vysoušecí zařízení: Biotage SPE Dry 96 nebo TurboVap 96.
• UHPLC: Shimadzu Nexera se sloupcem Restek Raptor Biphenyl (2,1×100 mm, 2,7 µm).
• Mobilní fáze: A – 1 mM amonný fluorid ve vodě; B – methanol; gradientní eluce 0–6,5 min.
• MS/MS: Sciex Triple Quad 5500, ESI v duální polaritě, MRM režim, teplota zdroje 600 °C, CUR 40, GS1 50, GS2 60.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje extrakčních výtěžků >80 % a RSD <5 % při koncentraci 40 ng/mL (ekvivalent 15 ng na kolonce).
Lineární rozsah 5–200 ng/mL s koeficientem determinace >0,998 pro všechny tři analyty; LOQ 5 ng/mL, LOD 2 ng/mL.
Porovnání s acetonitrilovým „solvent crash“ ukazuje výrazné snížení fosfolipidových interferencí v časových oknech 0–4 min (lysofosfolipidy) a 4–8 min (fosfolipidy).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysokou opakovatelnost a robustnost bez tvorby emulzí.
• Efektivní odstranění fosfolipidů s cílenou redukcí interferencí.
• Kompatibilitu s automatizovanou přípravou vzorků ve vysokém průtoku.
• Široký lineární rozsah vhodný pro klinické a farmakokinetické aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj bude směřovat k menší spotřebě vzorku a reagencií, plné automatizaci SLE+, integraci s online SPE–LC–MS systémy a rozšíření na multiplexní analýzy dalších polarních a kyselých metabolitů.
Možnosti využití zahrnují terapeutické monitorování, toxikologii a metabolomickou analýzu.

Závěr

Podporovaná liquid–liquid extrakce pomocí ISOLUTE SLE+ poskytuje rychlou, efektivní a reprodukovatelnou přípravu plazmových vzorků pro kvantitativní LC–MS/MS stanovení kyselých metabolitů katecholaminů.

Reference

• Biotage Application Note AN888: Extraction of Acidic Catecholamine Metabolites in Plasma Using ISOLUTE SLE+ Prior to LC–MS/MS, 2017.
• Sigma-Aldrich Company: vnitřní standardy D3-VMA, D5-HVA, D5-5-HIAA.