Searching for Alternative Danazol Metabolites Through Accurate Mass with LC/MS Q-TOF

Význam tématu

Detekce a charakterizace metabolitů syntetického steroidu danazolu je klíčová pro antidopingové laboratoře a regulační orgány. Vysoká přesnost měrné hmotnosti a rozlišení systémů LC/MS Q-TOF umožňuje identifikovat dosud neznámé metabolity a prodloužit detekční okno po podání. To přispívá ke spolehlivějšímu odhalování dopingu a lepšímu pochopení metabolických drah AAS.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo najít alternativní markerové metabolity danazolu v lidské moči za pomoci LC/MS Q-TOF s přesnou hmotností. Studie zahrnovala:

• Podání jednorázové 100mg dávky danazolu zdravému dobrovolníkovi.
• Sběr močových vzorků před podáním a po dobu až 30 dnů.
• Analýzu v pozitivním i negativním ionizačním režimu po jednoduché extrakci.
• Identifikaci a strukturální návrh nových mono- a dihydroxylovaných metabolitů.
• Hodnocení doby detekce jednotlivých markerů pomocí vylučovacích křivek.

Použitá instrumentace

Pro separaci a detekci bylo použito Agilent 1290 Infinity LC spojené s Agilent 6550 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS s iFunnel technologií a dvoutryským (AJS) ESI zdrojem.

Pracovní podmínky:

• Kolona Poroshell 120 EC-C18 (2,1×50 mm, 2,7 µm).
• Mobilní fáze: voda s 5 mM acetátovým pufrem (1 % octové kyseliny v pozitivním režimu) a acetonitril.
• Gradient od 10 do 75 % acetonitrilu za 12 min, na 90 % do 12,1 min, zpět na 10 % do 14 min.
• Průtok 0,4 mL/min, teplota kolony 50 °C.
• Režimy detekce: full-scan m/z 60–1 100 (3 spektra/s), cílené MS/MS m/z 60–1 100 (1,5 spektra/s) s kolizní energií 35 eV.
• Suchý plyn N₂ 12 L/min při 250 °C, tlak rozprašovače 40 psi, kapilární napětí 4 000 V, fragmentor 150 V.
• Denní kalibrace, korekce referenčním hmotnostním standardem, software Agilent MassHunter Workstation LC/MS.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky odhalily více než 20 metabolitů danazolu v moči. K hlavním objevům patří:

• Identifikace čtyř dosud nepopsaných dihydroxylovaných metabolitů: danazol PC+2OH (dva izomery) a danazol M1+2OH (dva izomery).
• Stanovení mono-hydroxylovaných derivátů M1 a M2, přičemž běžné markery ethisteron (M1) a 2α-hydroxymethylethisteron (M2) byly potvrzeny.
• MS/MS fragmentace umožnila navrhnout struktury a potvrdit pozice hydroxylací.
• Vylučovací křivky ukázaly, že jeden z izomerů M2+2OH lze detekovat až 16 dní po podání, což je nejdelší retrospektivní indikátor.

Přínosy a praktické využití metody

Díky vysokému rozlišení Q-TOF a přesné hmotnosti lze:

• Odhalit nové metabolity danazolu, které prodlužují detekční okno v dopingových testech.
• Zlepšit spolehlivost a citlivost analýz v antidopingových laboratořích.
• Minimalizovat falešně negativní výsledky při sledování užívání syntetických steroidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj vysoce výkonných hmotnostních analyzátorů poskytuje další možnosti:

• Rozšíření analýzy na další AAS a jejich konjugáty s využitím iontové mobility a datově nezávislé fragmentace.
• Integrace metod in silico predikce metabolitů a workflow pro neznámé látky.
• Automatizace přípravy vzorků a pokročilá bioinformatika pro rychlejší interpretaci dat.

Závěr

Studie prokázala efektivitu LC/MS Q-TOF při odhalování nových volných metabolitů danazolu, včetně čtyř doposud neznámých dihydroxylovaných látek. Jeden z těchto metabolitů je detekovatelný až 16 dní po podání, což výrazně prodlužuje retrospektivu v antidopingovém testování.

Reference

1. de Boer D., de Jong E. G., Maes R. A. A. The detection of danazol and its significance in doping analysis. J. Anal. Toxicol. 1992, 16, 14–18.
2. Chrostowski K., Kwiatkowska D., Partyka E., Wójcikowska-Wójcik B. Danazol detection in doping analysis in urine. In Recent Advances in Doping Analysis (6), Köln 1998, s. 53–64.
3. Kim J. Y. et al. GC-MS characterization of urinary metabolites and changes of ethisterone and testosterone profile after oral administration of danazol in equine. J. Vet. Pharmacol. Therap. 2001, 24, 147–153.
4. Montes de Oca Porto R. et al. Gas chromatography/mass spectrometry characterization of urinary metabolites of danazol after oral administration in human. J. Chromatogr. B. 2006, 830, 178–183.
5. Fragkaki A. G. et al. Schemes of metabolic patterns of anabolic androgenic steroids for the estimation of metabolites of designer steroids in human urine. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2009, 115, 44–61.