USING CHROMATOGRAPHIC RESOLUTION TO INCREASE SENSITIVITY AND SPECTRAL INFORMATION IN LC/MS PEPTIDE MAPPING

Význam tématu

Peptidová mapování kombinující kapalinovou chromatografii a hmotnostní spektrometrii jsou základem charakterizace proteinů a identifikace posttranslačních modifikací. Komplexní spektra z koelujících peptidů často omezují detekci nízce zastoupených složek. Zvýšení chromatografického rozlišení tak přímo zlepšuje citlivost a kvalitu získaných spekter.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo otestovat použití ultra vysokotlaké kapalinové chromatografie (UPLC) s velmi jemnými částicemi BEH C18 a odlišnými pórovými velikostmi sloupků (130 Å, 300 Å) spolu s úpravou mobilní fáze (trifluoroctová versus mravenčí kyselina) pro optimalizaci rozlišení, citlivosti a informačního obsahu v LC–MS peptidovém mapování.

Použitá instrumentace

• Kapalinová chromatografie: Waters AQUITY UPLC systém
• Kolony: BEH C18 1,7 μm (2,1×100 mm) s póry 130 Å a 300 Å
• Mobilní fáze A: voda/acetonitril s 0,02–0,1 % TFA nebo 0,1 % FA
• Gradient: 1,5 %/objemový gradient, průtok 100 μl/min, teplota 40 °C, objem injekce 10 μl
• Hmotnostní spektrometrie: Waters Q-Tof micro, ESI, capilára 3500 V, kónus 30 V, teplota zdroje 150 °C, desolvace 300 °C, kolizní energie 5 eV, rozsah m/z 400–1 800, rychlost snímání 2 sken/s

Hlavní výsledky a diskuse

UltraPerformance Liquid Chromatography s částicemi 1,7 μm přinesla výrazně užší a symetričtější peaky než konvenční HPLC s 3,5 μm částicemi, což vedlo k lepší separaci a vyšší citlivosti zejména pro nízkoabundantní peptidy. Použití mravenčí kyseliny místo TFA významně zvýšilo MS signál a podpořilo vyšší nabíjecí stavy, zatímco TFA přinesla vyšší retenci za cenu iontového potlačení. Snížení koncentrace TFA zmírnilo potlačení ionizace. Oba typy sloupků (130 Å i 300 Å) poskytly úzké peaky; sloupky s většími póry jsou však vhodnější pro sledování peptidů nad 3 000 Da. Jednoduché úpravy gradientu a modifikátoru mobilní fáze dovolily doladit selektivitu bez nutnosti tandemové MS.

Přínosy a praktické využití metody

• Citlivější a spolehlivější detekce nízkoabundantních peptidů
• Jednodušší spektrální interpretace v režimu MS-only
• Možnost rychlých úprav separačních parametrů bez ztráty signálu
• Vhodné pro rutinní QA/QC i výzkumné laboratoře v proteomice

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zmenšování částic a kombinace povrchových úprav sloupků pro minimalizaci tailingu
• Optimalizace nových mobilních fáze modifikátorů s cílem lepší selektivity
• Integrace UPLC-MS do vysokopropustných workflow proteomiky
• Využití větších pórových sloupců pro analýzu makromolekulárních komplexů

Závěr

Spojení UPLC se sloupky BEH C18 malých částic, vhodnou volbou mobilní fáze a optimalizací pore size významně zvyšuje chromatografické rozlišení, citlivost i kvalitu hmotnostních spekter peptidového mapování. Tento přístup zefektivňuje analýzu proteinových digesátů bez nutnosti rozsáhlého tandemového skenování.

Reference

1. Mazzeo JR, Wheat TA, Gillece-Castro BL, Lu Z. Application of UPLC for Peptide Mapping. BioPharm International. 2006;1–9.